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王小燕30

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
30楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-18 16:58:22
楼主的PCR明显的出现了涂带,我大概知道原因。

我把你的问题发给我美国的师姐(她就是 本版的 顾问 凌波丽),我明天上午大概能够得到她的回复(美国跟这里有数小时的时差),看她是否同意我的见解,明天或者回复 ...

先谢谢你这么费心了,,,太感谢大家了。。我做了很久实验一直这样拖尾😌,都不知道怎么办了。提模板DNA效果也不好

[ 发自小木虫客户端 ]
31楼2015-06-18 20:51:58
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:46:35
我师姐 凌波丽回复的。

长程PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策(包括PCR原因和电泳原因)

凌波丽

    长程PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因:
   一、PCR反应的原因:
       酶量过多,DNA模板量过大,dNTP浓度过高,退火温度过低,循环次数过多。DNA模板不纯,PCR操作时有外源的DNA污染。
     大于3kb的DNA一般用Long-Range PCR。Long-Range PCR的酶的保真性一般比较好,酶的保真问题一般不会引起地毯带或者涂带。
    二、电泳检测出的问题。
    三、长程PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的不太可能的原因是:
1.引物的专一性差一般会有异常扩增带,但是一般不会出现涂带和地毯带。
2.引物二聚体形成一般也只会出现异常扩增带,通常分子量很小,也不会出现一般不会出现涂带和地毯带。
3.Long-Range PCR的酶的保真性一般比较好,酶的保真性问题一般不会引起地毯带或者涂带。

    针对各种原因的相应的对策有:
1.减少酶量分梯度上下调一调,可以参考说明书。
2. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前,不要大范围地变动反应体系的复性温度,要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增,则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。具体调节可以参考说明书。
3.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时,非特异性扩增较多,这时,最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环,退火温度降低1-2度,直至到达正常的Tm附近的退火温度。具体调节可以参考说明书。
4.可以改用巢式PCR。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。
5. 保证PCR反应的DNA模板的质量,要用电泳检测一下分子量和纯度,质量不好则要重新提取和纯化DNA模板;适当增加DNA模板量,减少循环次数。还要注意模板DNA是否发生了降解。
6.操作时要防止外源DNA污染,尤其是用微量移液器时,要在消毒棉塞在“枪头”与微量移液器的吸管之间,或者购置专门的有在两者之间有隔膜的专用微量移液器。
7.适当减少DNA模板量,可以梯度减少。
8.适当减少循环次数,一般也就循环25次就差不多了。

9.电泳检测的原因:
还有一个原因,我过去一直没有考虑到,因为在2014年暑假里,凌波丽重新实际学习和操作了DNA分离提纯(抽提和电泳),基因克隆和定量PCR等基本的分子生物学操作后想到的。
   PCR本身么有问题,问题出在DNA电泳操作这一步。
   DNA电泳拖尾
   电压过大,根据电泳槽设置合适的电压;
   缓冲溶液离子浓度过高,调整盐浓度在0.1mol/L以下;
   DNA上样量过多,稀释DNA样品浓度或者减少上样量;
   DNA发生了降解,重新提取DNA,并且加入DNase的抑制剂或者足够量的蛋白质的变性剂或者蛋白酶K。
电泳用的琼脂糖凝胶浓度与DNA的分子量不匹配,浓度度过小导致大小的DNA都穿透了凝胶。
32楼2015-06-19 10:42:44
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

我的美国师姐回答的已经够全面,无论是PCR本身,还是DNA电泳,她还是说准备再查一下文献在继续讨论。她7月就回国度假了,到时你可以直接与她讨论。
33楼2015-06-19 10:45:37
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

不要以讨论PCR,就说是酶有问题,引物专一性不够。

引物专一性不够,但是引物都是化学合成的,总不会是N种引物混合到一起当作一次反应的PCR反应的一对引物去做吧。既然不是如此,怎么可能会有涂带和地毯带哪?有涂带和地毯带的出现如果真的是如果是引物问题,那么必须是N种引物在同一次PCR起作用。

这贴是我写的,上面署名 凌波丽 的帖子是我在美国的师姐写的,两个讨论帖都是第一次发布。
34楼2015-06-19 10:52:07
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qaz139687

新虫 (小有名气)

引用回帖:
33楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-19 10:45:37
我的美国师姐回答的已经够全面,无论是PCR本身,还是DNA电泳,她还是说准备再查一下文献在继续讨论。她7月就回国度假了,到时你可以直接与她讨论。

有个大神师姐带真好可怜我实验室每一个人会的
35楼2015-06-19 10:52:58
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

我的师姐的邮箱(被我公布在小木虫的那个)近日被人黑掉了,看来小木虫里也有少数心术不正的人。

我师姐用电子邮件告诉我:她写的PCR系列的凌波丽个人总结草稿现在已经堆到了35000字,她说完成的话,字数至少要乘以3。
36楼2015-06-19 10:57:31
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
35楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-06-19 10:52:58
有个大神师姐带真好可怜我实验室每一个人会的...

发上来,大家共同讨论嘛。我的美国师姐下月初就回国过暑假了。到时你也可以与她讨论。
37楼2015-06-19 10:59:34
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王小燕30

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
32楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-19 10:42:44
我师姐 凌波丽回复的。

长程PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策(包括PCR原因和电泳原因)

凌波丽

    长程PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因:
   一、PCR反应的原因:
    ...

师姐果然厉害!

[ 发自小木虫客户端 ]
38楼2015-06-19 11:26:56
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王小燕30

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
33楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-19 10:45:37
我的美国师姐回答的已经够全面,无论是PCR本身,还是DNA电泳,她还是说准备再查一下文献在继续讨论。她7月就回国度假了,到时你可以直接与她讨论。

恩,回头我怎么联系上她哦?而且她忙不,我这样打扰方便不?   非常感谢了😁

[ 发自小木虫客户端 ]
39楼2015-06-19 11:28:35
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
39楼: Originally posted by 王小燕30 at 2015-06-19 11:28:35
恩,回头我怎么联系上她哦?而且她忙不,我这样打扰方便不?   非常感谢了😁
...

我的美国师姐 是生物综合版和分子生物版的顾问:凌波丽,她回国时会上小木虫,你也可以用站内邮件联系她。
40楼2015-06-19 11:34:43
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