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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 跑出来的PCR结果一直是这样的，不知各位大虾可否指点指点，多谢多谢
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王小燕30

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
30楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-18 16:58:22
楼主的PCR明显的出现了涂带，我大概知道原因。

我把你的问题发给我美国的师姐（她就是 本版的 顾问 凌波丽），我明天上午大概能够得到她的回复（美国跟这里有数小时的时差），看她是否同意我的见解，明天或者回复 ...

先谢谢你这么费心了，，，太感谢大家了。。我做了很久实验一直这样拖尾😌，都不知道怎么办了。提模板DNA效果也不好

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31楼2015-06-18 20:51:58
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:46:35
我师姐 凌波丽回复的。

长程PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策（包括PCR原因和电泳原因）

凌波丽

    长程PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因：
   一、PCR反应的原因：
       酶量过多，DNA模板量过大，dNTP浓度过高，退火温度过低，循环次数过多。DNA模板不纯，PCR操作时有外源的DNA污染。
     大于3kb的DNA一般用Long-Range PCR。Long-Range PCR的酶的保真性一般比较好，酶的保真问题一般不会引起地毯带或者涂带。
    二、电泳检测出的问题。
    三、长程PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的不太可能的原因是：
1.引物的专一性差一般会有异常扩增带，但是一般不会出现涂带和地毯带。
2.引物二聚体形成一般也只会出现异常扩增带，通常分子量很小，也不会出现一般不会出现涂带和地毯带。
3.Long-Range PCR的酶的保真性一般比较好，酶的保真性问题一般不会引起地毯带或者涂带。

    针对各种原因的相应的对策有：
1.减少酶量分梯度上下调一调，可以参考说明书。
2. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。具体调节可以参考说明书。
3.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。具体调节可以参考说明书。
4.可以改用巢式PCR。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。
5. 保证PCR反应的DNA模板的质量，要用电泳检测一下分子量和纯度，质量不好则要重新提取和纯化DNA模板；适当增加DNA模板量，减少循环次数。还要注意模板DNA是否发生了降解。
6.操作时要防止外源DNA污染，尤其是用微量移液器时，要在消毒棉塞在“枪头”与微量移液器的吸管之间，或者购置专门的有在两者之间有隔膜的专用微量移液器。
7.适当减少DNA模板量，可以梯度减少。
8.适当减少循环次数，一般也就循环25次就差不多了。

9.电泳检测的原因：
还有一个原因，我过去一直没有考虑到，因为在2014年暑假里，凌波丽重新实际学习和操作了DNA分离提纯（抽提和电泳），基因克隆和定量PCR等基本的分子生物学操作后想到的。
   PCR本身么有问题，问题出在DNA电泳操作这一步。
   DNA电泳拖尾
   电压过大，根据电泳槽设置合适的电压；
   缓冲溶液离子浓度过高，调整盐浓度在0.1mol/L以下；
   DNA上样量过多，稀释DNA样品浓度或者减少上样量；
   DNA发生了降解，重新提取DNA，并且加入DNase的抑制剂或者足够量的蛋白质的变性剂或者蛋白酶K。
电泳用的琼脂糖凝胶浓度与DNA的分子量不匹配，浓度度过小导致大小的DNA都穿透了凝胶。
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32楼2015-06-19 10:42:44
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calorimetry

铜虫 (正式写手)
我的美国师姐回答的已经够全面，无论是PCR本身，还是DNA电泳，她还是说准备再查一下文献在继续讨论。她7月就回国度假了，到时你可以直接与她讨论。
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33楼2015-06-19 10:45:37
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calorimetry

铜虫 (正式写手)
不要以讨论PCR，就说是酶有问题，引物专一性不够。

引物专一性不够，但是引物都是化学合成的，总不会是N种引物混合到一起当作一次反应的PCR反应的一对引物去做吧。既然不是如此，怎么可能会有涂带和地毯带哪？有涂带和地毯带的出现如果真的是如果是引物问题，那么必须是N种引物在同一次PCR起作用。

这贴是我写的，上面署名 凌波丽 的帖子是我在美国的师姐写的，两个讨论帖都是第一次发布。
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34楼2015-06-19 10:52:07
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
33楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-19 10:45:37
我的美国师姐回答的已经够全面，无论是PCR本身，还是DNA电泳，她还是说准备再查一下文献在继续讨论。她7月就回国度假了，到时你可以直接与她讨论。

有个大神师姐带真好可怜我实验室每一个人会的
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35楼2015-06-19 10:52:58
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calorimetry

铜虫 (正式写手)
我的师姐的邮箱（被我公布在小木虫的那个）近日被人黑掉了，看来小木虫里也有少数心术不正的人。

我师姐用电子邮件告诉我：她写的PCR系列的凌波丽个人总结草稿现在已经堆到了35000字，她说完成的话，字数至少要乘以3。
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36楼2015-06-19 10:57:31
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calorimetry

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
35楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-06-19 10:52:58
有个大神师姐带真好可怜我实验室每一个人会的...

发上来，大家共同讨论嘛。我的美国师姐下月初就回国过暑假了。到时你也可以与她讨论。
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37楼2015-06-19 10:59:34
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王小燕30

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
32楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-19 10:42:44
我师姐 凌波丽回复的。

长程PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策（包括PCR原因和电泳原因）

凌波丽

    长程PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因：
   一、PCR反应的原因：
    ...

师姐果然厉害！

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38楼2015-06-19 11:26:56
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王小燕30

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
33楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-19 10:45:37
我的美国师姐回答的已经够全面，无论是PCR本身，还是DNA电泳，她还是说准备再查一下文献在继续讨论。她7月就回国度假了，到时你可以直接与她讨论。

恩，回头我怎么联系上她哦？而且她忙不，我这样打扰方便不？   非常感谢了😁

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39楼2015-06-19 11:28:35
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calorimetry

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
39楼: Originally posted by 王小燕30 at 2015-06-19 11:28:35
恩，回头我怎么联系上她哦？而且她忙不，我这样打扰方便不？   非常感谢了😁
...

我的美国师姐 是生物综合版和分子生物版的顾问：凌波丽，她回国时会上小木虫，你也可以用站内邮件联系她。
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40楼2015-06-19 11:34:43
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