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[求助]
跑出来的PCR结果一直是这样的，不知各位大虾可否指点指点，多谢多谢 已有11人参与
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应该跑出目的条带的，可是一直是拖尾，从加样孔就开始拖。。。。 怎么办，是什么问题呢希望各位大哥大姐路过的看过的给指点指点哦  IMG_20150610_124807.jpg  IMG_20150616_120302.jpg  IMG_20150616_120356.jpg |
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【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:46:35
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-06-19 20:46:35
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我师姐 凌波丽回复的。 长程PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策（包括PCR原因和电泳原因） 凌波丽 长程PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因： 一、PCR反应的原因： 酶量过多，DNA模板量过大，dNTP浓度过高，退火温度过低，循环次数过多。DNA模板不纯，PCR操作时有外源的DNA污染。 大于3kb的DNA一般用Long-Range PCR。Long-Range PCR的酶的保真性一般比较好，酶的保真问题一般不会引起地毯带或者涂带。 二、电泳检测出的问题。 三、长程PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的不太可能的原因是： 1.引物的专一性差一般会有异常扩增带，但是一般不会出现涂带和地毯带。 2.引物二聚体形成一般也只会出现异常扩增带，通常分子量很小，也不会出现一般不会出现涂带和地毯带。 3.Long-Range PCR的酶的保真性一般比较好，酶的保真性问题一般不会引起地毯带或者涂带。 针对各种原因的相应的对策有： 1.减少酶量分梯度上下调一调，可以参考说明书。 2. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。具体调节可以参考说明书。 3.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。具体调节可以参考说明书。 4.可以改用巢式PCR。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。 5. 保证PCR反应的DNA模板的质量，要用电泳检测一下分子量和纯度，质量不好则要重新提取和纯化DNA模板；适当增加DNA模板量，减少循环次数。还要注意模板DNA是否发生了降解。 6.操作时要防止外源DNA污染，尤其是用微量移液器时，要在消毒棉塞在“枪头”与微量移液器的吸管之间，或者购置专门的有在两者之间有隔膜的专用微量移液器。 7.适当减少DNA模板量，可以梯度减少。 8.适当减少循环次数，一般也就循环25次就差不多了。 9.电泳检测的原因： 还有一个原因，我过去一直没有考虑到，因为在2014年暑假里，凌波丽重新实际学习和操作了DNA分离提纯（抽提和电泳），基因克隆和定量PCR等基本的分子生物学操作后想到的。 PCR本身么有问题，问题出在DNA电泳操作这一步。 DNA电泳拖尾 电压过大，根据电泳槽设置合适的电压； 缓冲溶液离子浓度过高，调整盐浓度在0.1mol/L以下； DNA上样量过多，稀释DNA样品浓度或者减少上样量； DNA发生了降解，重新提取DNA，并且加入DNase的抑制剂或者足够量的蛋白质的变性剂或者蛋白酶K。 电泳用的琼脂糖凝胶浓度与DNA的分子量不匹配，浓度度过小导致大小的DNA都穿透了凝胶。 |
32楼2015-06-19 10:42:44
2楼2015-06-16 20:19:10
3楼2015-06-16 20:33:08
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我做的是长距离PCR，要跑出的条带是12000和11000，就是应该是电泳图上最上边两条marker之间的条带。一直是拖尾。 三条引物是：（上游引物）P：5’一GCC CTG CCT GTC CAT TAC ACT GAT GAC ATT ATG CTG AC-3’ （下游引物）Q：5'-GGC CCT ACA ACC ATT CTG CCT TTC ACT TTC AGT GCA ATA-3’ （下游引物）B：5’-CCC CAA ACT ATA ACC AGC ACC TTG AAC TTC CCC TCT CATA-3’； 反应体系：引物P、Q、B(20 pmol／ul)分别2ul、1ul、1ul，模板基因组DNA 2ul(约100 ng)，TaKaRa LA Taq酶0．25ul(5 U／ul)，2×GC缓冲液I 12．5ul，dNTP 4ul，蒸馏水补足，总反应体积25ul。 反应条件：94℃预变性2 min，前10个循环98℃变性10 s，68℃退火／延伸10 min，后20个循环98℃变性10 s，68℃延伸10 min 20s，共进行30个循环。电泳：配制6g/L琼脂糖凝胶，PCR产物5ul与6×上样缓冲液1ul混匀上样，在恒压75 V电泳，成像 我就是想问问这样拖带可能跟什么关系最大  我做的时候就一直在变化引物浓度比例，和退火温度。用梯度PCR仪做过，退火温度从65、66、-69、70，也没什么明显的结果条带哦 |
4楼2015-06-16 21:55:43
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