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mu_mao

新虫 (小有名气)

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[求助] 求助WB中SDS电泳(总有一个泳道跑偏）和转膜（电压升不上去）的问题

初学Western，已经做了两个月了，最开始的三次做的还行，不过上样量不好，第四次开始就死活做不好了。
起初是只有内参条带，其余的一概曝不出，陆陆续续的，能换的都换了。现在发现可能是转膜出了问题。
最新的一次做出来的结果如下

这是两张膜的结果，最宽亮的是内参GAPDH，内参上方应该有个目的条带65k，没爆出来
内参下方23k的目的条带，下面的那张膜爆出来了，但是颜色很浅，需要曝光5分钟左右才能看到。
两张膜对应的第四泳道均出现了问题，导致内参下移，23k的目的条带第四泳道直接看不到了。
我用的是湿转法
目前发现的问题是，电泳时候，有时候是左边起第四泳道，有时候是右边起第四泳道，溴酚蓝跑的偏快一点点。
转膜时候，看网上资料有人限流300mA，此时我的电压只有85v左右。
我调到最大电流400mA时，电压也只有95v，随着转膜时间增加，电流太大，放热大，冰浴效果跟不上，电压会降到75v。
根本达不到网上说的100~120v
之前转1~2小时，只有内参有条带，现在转4个小时，23k的条带曝光5分钟可见，但是65k的，一直看不到。
抗体肯定没问题，第一次做的时候，300mA转了1小时，23k，65k，都看到了。现在死活重复不出来了。。。已经快两个月了
求有经验的同学指点迷津

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