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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求各位前辈帮帮忙吧，快疯了。。。
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崔兵杰

新虫 (初入文坛)

[交流] 求各位前辈帮帮忙吧，快疯了。。。 已有9人参与

　　我做的是真菌基因组ＤＮＡ提取，做了好久，电泳才好歹有了个结果（图１最右边一个），ｍａｒｋｅｒ用的Ｄ２０００，也不知道这是不是ＤＮＡ。然后又做ＰＣＲ，就是做不出东西，ＰＣＲ的原材料都是去年老师买的，学姐用过的，据说什么都没做出来。
　　ＰＣＲ总体系为５０微，包括　 10×扩增缓冲液 　　　　　５ul
•        　　　　　　  　　　　　　　dNTP混合物 　 　　　　　１ul
•        　　　　　　　　　　　　　 引物 （１００ｕＭ）　　　各２ul　
•        　　　　　　　　　　　　　 模板DNA 　　　 　　　　１．５ul　
•        　　　　　　　　　　 Taq DNA聚合酶 （５Ｕ／ul）　　０．４ul　
•        　　　　　　　　　　　　 ２５ｍＭ　Mg2+　　　　　　３ul
•        　　　　　　　　　　　　　 加双蒸水至 　　　　　　　５０ul
　　反应程序如下：９４℃　３ｍｉｎ，
　　　　　　　　　９４℃　１ｍｉｎ，
　　　　　　　　　起始退火温度４８℃　１ｍｉｎ，
　　　　　　　　　７２℃　３ｍｉｎ，
　　　　　　　　　３０个循环后７２℃　１０ｍｉｎ，
　　模板用的图１最右边的样品，引物是ＮＳ１和ＮＳ８，因为计算这两个引物ＴＭ值相差比较大，一个４９℃，一个５９℃，相差有１０度，所以每循环退火温度升高０．４℃（这是叫ｔｏｕｃｈ－ｄｏｗｎ　ＰＣＲ吗？），结果就做出了图２的样子，全是引物二聚体了？ｍａｒｋｅｒ用的Ｄ２０００。
　　我只有六个金币，跪求各位前辈帮帮忙啊，小弟感激不尽！！！
求各位前辈帮帮忙吧，快疯了。。。
图１.JPG


求各位前辈帮帮忙吧，快疯了。。。-1
图２.jpg
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xueyuxx

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1楼 2015-05-25 22:07:51
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崔兵杰

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jkamm at 2015-05-26 00:26:41
本人认为不是引物问题就是模板质量问题了

那是需要买新的引物或者重新提ＤＮＡ　？
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4楼2015-05-26 08:41:17
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xueyuxx

木虫 (小有名气)
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2楼2015-05-25 22:16:24
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jkamm

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本人认为不是引物问题就是模板质量问题了
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3楼2015-05-26 00:26:41
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xiaoyangren7

金虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-05-26 23:02:23
没做过真菌，首先提取的DNA做凝胶电泳，要确定是你需要大小的基因组，PCR时应该做个阳性对照组，一般是保守序列，如果阳性对照P的出，说明模板没有问题。PCR最不出很多原因，我之前有时退火温度相差4度就做不出，可以设温度梯度PCR
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崔兵杰
5楼2015-05-26 09:32:22
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崔兵杰

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
5楼: Originally posted by xiaoyangren7 at 2015-05-26 09:32:22
没做过真菌，首先提取的DNA做凝胶电泳，要确定是你需要大小的基因组，PCR时应该做个阳性对照组，一般是保守序列，如果阳性对照P的出，说明模板没有问题。PCR最不出很多原因，我之前有时退火温度相差4度就做不出，可 ...

能具体说说怎么做吗，不大懂这些，怎么做阳性对照组？
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6楼2015-05-26 10:12:37
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清雅风

木虫 (著名写手)
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-05-26 23:02:45
首先楼主可以设置一个退火温度梯度，如果跑出来还是那样子就得考虑一下基因组的质量了。我之前也遇到了这样的情况，重复了好多次都跑不出来，而且基因组跑出来是弥散的，那是因为菌没有养好，基因组的质量不好
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朝着自己的理想奔跑，就是幸福！
7楼2015-05-26 10:35:05
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-05-26 23:03:00
根据marker看胶是否有问题，marker的条带都不是很清楚，胶的质量需要改正，还有胶浓度多少？
此外，扩增没有得到目的条带而且引物二聚体严重，首先判断模板没有降解，其次引物设计的合理性需要验证，提高PCR扩增的特异性方法有很多，建议换试剂已经一年了，基本上酶啊buffer啊保质期都是一年的，可以使用特异性高的酶扩增 热启动酶，能够避免引物二聚体和其他的非特异性条带
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崔兵杰
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
8楼2015-05-26 11:27:11
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崔兵杰

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
8楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-05-26 11:27:11
根据marker看胶是否有问题，marker的条带都不是很清楚，胶的质量需要改正，还有胶浓度多少？
此外，扩增没有得到目的条带而且引物二聚体严重，首先判断模板没有降解，其次引物设计的合理性需要验证，提高PCR扩增的 ...

我重新提的ＤＮＡ，模板除了ＲＮＡ多一点，别的应该是没问题的，条带不清楚应该是ＥＢ的问题，这个我可以肯定，胶是用的１％的，重新做了一次，材料换了另外一个老师的，结果还是那样，怎么解啊？
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9楼2015-05-27 14:29:26
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
★
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引用回帖:
9楼: Originally posted by 崔兵杰 at 2015-05-27 14:29:26
我重新提的ＤＮＡ，模板除了ＲＮＡ多一点，别的应该是没问题的，条带不清楚应该是ＥＢ的问题，这个我可以肯定，胶是用的１％的，重新做了一次，材料换了另外一个老师的，结果还是那样，怎么解啊？...

你的目的片段式多大？用1%的胶，我觉得你的胶没有制好啊，marker也是有挂孔的是吧？新提的模板应该就没问题了，条带不是不清楚，是EB的问题，你是如何肯定的？可能是引物不合理所以没有扩增出目的条带，但是最下面亮的是引物二聚体，但是都那么奇怪，还是觉得胶有问题同时没有扩增出目的片段，考虑下引物
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
10楼2015-05-27 15:04:12
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