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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求各位前辈帮帮忙吧，快疯了。。。
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lakool

木虫 (小有名气)
★
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要是找问题的话还是对比做一下实验。
假设试剂和引物都有影响
一、用可靠DNA，换可靠引物，二换可靠DNA，用ＮＳ１和ＮＳ８引物。三可以用你提的DNA和可靠引物。做PCR跑胶
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11楼2015-05-28 16:55:39
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没想好名字

新虫 (初入文坛)
★
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老实说，第一块胶你能把Market跑成这样也算是了不起了，同时你的Market选择不对，基因组你至少要用1W及以上的Market.dNTP加的太少，应该加5ul左右。变性和退火时间应改为30S，延伸时间过长，一般延伸的速度在1KBP到2KBP。同时降落PCR是用来优化条件的，不代表你能直接通过降落PCR做出结果，你错误太多了，建议好好看下基因工程这本书
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12楼2015-05-29 12:46:47
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xmcliulei

银虫 (小有名气)
★
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朋友我感觉你的引物浓度过高，正常PCR用的是5μM 上下游各1.5μL，最大浓度是10μM，这个量在整个体系中已经是过量的了。100μM引物做PCR肯定都是引物二聚体，因为引物已经超过量了，大量的引物已经把模板的扩增竞争掉了。另外给你两点建议：1、给模板定量，调整模板总input在160ng左右；2、做个退火温度的梯度，摸索一个比较靠谱的温度再做touch down。
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13楼2015-05-30 00:04:39
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北斗虫儿

木虫 (正式写手)
★
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本科做过真菌的，不过做的是ITS序列。楼主的区域没记错的话是lager rDNA。
真菌的NS1和NS8引物扩增的片段好长的。。。。你确定短短的1分钟就能扩增出来。
没记错的话大约有3-4kb，请多查资料吧。
1）胶没问题，我当年也是1%的。
2)就本人认为，要换一种扩增体系了，因为简单的taq酶肯定是不行的
3）先探索温度，在做touch-PCR
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14楼2015-05-30 06:52:36
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北斗虫儿

木虫 (正式写手)
★
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还得补充说明一下，我记得好像还有一个可移动内含子I，其会影响结果。没有可移动内含子，序列可能会短点，不过大约也在2kb左右。。。。。我只能帮到你这里了。如有错误，纯属记忆差。
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15楼2015-05-30 07:05:50
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