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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求各位前辈帮帮忙吧，快疯了。。。
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崔兵杰

新虫 (初入文坛)

[交流] 求各位前辈帮帮忙吧，快疯了。。。 已有9人参与

　　我做的是真菌基因组ＤＮＡ提取，做了好久，电泳才好歹有了个结果（图１最右边一个），ｍａｒｋｅｒ用的Ｄ２０００，也不知道这是不是ＤＮＡ。然后又做ＰＣＲ，就是做不出东西，ＰＣＲ的原材料都是去年老师买的，学姐用过的，据说什么都没做出来。
　　ＰＣＲ总体系为５０微，包括　 10×扩增缓冲液 　　　　　５ul
•        　　　　　　  　　　　　　　dNTP混合物 　 　　　　　１ul
•        　　　　　　　　　　　　　 引物 （１００ｕＭ）　　　各２ul　
•        　　　　　　　　　　　　　 模板DNA 　　　 　　　　１．５ul　
•        　　　　　　　　　　 Taq DNA聚合酶 （５Ｕ／ul）　　０．４ul　
•        　　　　　　　　　　　　 ２５ｍＭ　Mg2+　　　　　　３ul
•        　　　　　　　　　　　　　 加双蒸水至 　　　　　　　５０ul
　　反应程序如下：９４℃　３ｍｉｎ，
　　　　　　　　　９４℃　１ｍｉｎ，
　　　　　　　　　起始退火温度４８℃　１ｍｉｎ，
　　　　　　　　　７２℃　３ｍｉｎ，
　　　　　　　　　３０个循环后７２℃　１０ｍｉｎ，
　　模板用的图１最右边的样品，引物是ＮＳ１和ＮＳ８，因为计算这两个引物ＴＭ值相差比较大，一个４９℃，一个５９℃，相差有１０度，所以每循环退火温度升高０．４℃（这是叫ｔｏｕｃｈ－ｄｏｗｎ　ＰＣＲ吗？），结果就做出了图２的样子，全是引物二聚体了？ｍａｒｋｅｒ用的Ｄ２０００。
　　我只有六个金币，跪求各位前辈帮帮忙啊，小弟感激不尽！！！
求各位前辈帮帮忙吧，快疯了。。。
图１.JPG


求各位前辈帮帮忙吧，快疯了。。。-1
图２.jpg
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1楼 2015-05-25 22:07:51
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北斗虫儿

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本科做过真菌的，不过做的是ITS序列。楼主的区域没记错的话是lager rDNA。
真菌的NS1和NS8引物扩增的片段好长的。。。。你确定短短的1分钟就能扩增出来。
没记错的话大约有3-4kb，请多查资料吧。
1）胶没问题，我当年也是1%的。
2)就本人认为，要换一种扩增体系了，因为简单的taq酶肯定是不行的
3）先探索温度，在做touch-PCR
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14楼2015-05-30 06:52:36
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xueyuxx

木虫 (小有名气)
送红花一朵
围观。。。。
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2楼2015-05-25 22:16:24
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jkamm

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本人认为不是引物问题就是模板质量问题了
赞一下 回复此楼
3楼2015-05-26 00:26:41
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崔兵杰

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jkamm at 2015-05-26 00:26:41
本人认为不是引物问题就是模板质量问题了

那是需要买新的引物或者重新提ＤＮＡ　？
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2015-05-26 08:41:17
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