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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 新手测序遇到问题，向各位虫子求助
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liuli124125

铜虫 (初入文坛)

[交流] 新手测序遇到问题，向各位虫子求助

我在所测得的序列中怎么也找不到下游引物序列，是测序的问题吗还是我的PCR过程出了问题呀。我用的是菌液去测序的，引物是简并引物。问题到底在哪里，我应该怎么去解决呀。向高手们求助了，谢谢。
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1楼 2008-07-13 00:39:39
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superarm

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
凭我的经验有两种可能
1.你的结果的假阳性，是单引物，就是上游引物扩增的结果
2.DNA片断一部分缺失
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与分子生物学的同仁一起遨游科学的海洋！
2楼2008-07-13 00:52:30
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖
测序的问题可能性比较大，换个公司测，或是重测。
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活着就要让人感受到你的存在。
3楼2008-07-13 10:09:57
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
你是单向测的还是双向测的？如果是单向，也可能是你的插入片段比较长没测通吧？
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
4楼2008-07-13 10:37:41
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liuli124125

铜虫 (初入文坛)
我测的是两个反应，测得的大小也与预期差不多。 那我只有重新做过去测了哦，如果我不做TA克隆直接用PCR产物去测，提供简并引物给他，可行不呀？
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5楼2008-07-13 23:14:58
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mqy20020901

金虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖
是表达载体么？或是你保存的菌时间长了吧，建议重新做后再来测序。
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6楼2008-07-13 23:28:14
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xyklmu

至尊木虫 (知名作家)

虫眼看世界
★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+4,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
一般来说，测序反应很少用简并引物的。公司也不愿意接受简并引物去测序，大都是通用引物来测序的，如T3 T7 M13F M13R等。楼主始终未提及，公司是用什么引物测序的，是自己的简并引物还是通用引物？
由于下游引物的方向和测序模板是反向互补的，你可能需要在测序结果的反向互补序列中去找另一个引物。
测序之前是如何验证的？大小与预期相符？
另外，由于是兼并引物（不知道你的简并性有多高？），其在模板上的结合位点就有可能有多个。只要测出来的是你想要的东西，这个时候大可不必介意是否找到引物。
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位卑未敢忘忧国。
7楼2008-07-14 01:06:22
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figo.339

木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享，欢迎常来
最好不要用PCR产物测序，自我感觉现在这方面的技术还不太成熟，07年我测过，送去后说浓度低。没有结果。
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8楼2008-07-14 20:36:17
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liuli124125

铜虫 (初入文坛)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):thx
我用的是TAKARA的pMD-19 T载体，菌也是新鲜的。反向互补也找过了，还是没有，在此谢过各位给我提供的非常好的建议。祝你们实验顺利了。
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9楼2008-07-15 00:18:21
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xyklmu

至尊木虫 (知名作家)

虫眼看世界
有可能是没有测通，所以你找不到另一端的引物。
最好不要用pcr反应产物去测序，虽说现在有不少这样的业务，大多数还是认同克隆测序的。如果用于这次测序的引物是你自己提供的简并引物的话，很有可能是找不到的。
如果你只是找不到扩增引物的序列，但是能找到后面所要扩增的序列的话，那么可能还是因为测序引物离你的扩增片断太近。 如果不是这种情况，那么可能是你根本没有将扩增片断成功连入。 当然还有一种可能是公司测序送错了结果，把别人的结果送给了你，呵呵。
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位卑未敢忘忧国。
10楼2008-07-15 03:44:20
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