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liuli124125

铜虫 (初入文坛)

[交流] 新手测序遇到问题,向各位虫子求助

我在所测得的序列中怎么也找不到下游引物序列,是测序的问题吗还是我的PCR过程出了问题呀。我用的是菌液去测序的,引物是简并引物。问题到底在哪里,我应该怎么去解决呀。向高手们求助了,谢谢。
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superarm

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
凭我的经验有两种可能
1.你的结果的假阳性,是单引物,就是上游引物扩增的结果
2.DNA片断一部分缺失
与分子生物学的同仁一起遨游科学的海洋!
2楼2008-07-13 00:52:30
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖
测序的问题可能性比较大,换个公司测,或是重测。
活着就要让人感受到你的存在。
3楼2008-07-13 10:09:57
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
你是单向测的还是双向测的?如果是单向,也可能是你的插入片段比较长没测通吧?
漫洒英雄泪,相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行?一任俺芒鞋破钵随缘化!
4楼2008-07-13 10:37:41
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liuli124125

铜虫 (初入文坛)

我测的是两个反应,测得的大小也与预期差不多。 那我只有重新做过去测了哦,如果我不做TA克隆直接用PCR产物去测,提供简并引物给他,可行不呀?
5楼2008-07-13 23:14:58
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mqy20020901

金虫 (小有名气)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖
是表达载体么?或是你保存的菌时间长了吧,建议重新做后再来测序。
6楼2008-07-13 23:28:14
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xyklmu

至尊木虫 (知名作家)

虫眼看世界

★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+4,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
一般来说,测序反应很少用简并引物的。公司也不愿意接受简并引物去测序,大都是通用引物来测序的,如T3 T7 M13F M13R等。楼主始终未提及,公司是用什么引物测序的,是自己的简并引物还是通用引物?
由于下游引物的方向和测序模板是反向互补的,你可能需要在测序结果的反向互补序列中去找另一个引物。
测序之前是如何验证的?大小与预期相符?
另外,由于是兼并引物(不知道你的简并性有多高?),其在模板上的结合位点就有可能有多个。只要测出来的是你想要的东西,这个时候大可不必介意是否找到引物。
位卑未敢忘忧国。
7楼2008-07-14 01:06:22
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figo.339

木虫 (著名写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
最好不要用PCR产物测序,自我感觉现在这方面的技术还不太成熟,07年我测过,送去后说浓度低。没有结果。
8楼2008-07-14 20:36:17
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liuli124125

铜虫 (初入文坛)


reasonspare(金币+1,VIP+0):thx
我用的是TAKARA的pMD-19 T载体,菌也是新鲜的。反向互补也找过了,还是没有,在此谢过各位给我提供的非常好的建议。祝你们实验顺利了。
9楼2008-07-15 00:18:21
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xyklmu

至尊木虫 (知名作家)

虫眼看世界

有可能是没有测通,所以你找不到另一端的引物。
最好不要用pcr反应产物去测序,虽说现在有不少这样的业务,大多数还是认同克隆测序的。如果用于这次测序的引物是你自己提供的简并引物的话,很有可能是找不到的。
如果你只是找不到扩增引物的序列,但是能找到后面所要扩增的序列的话,那么可能还是因为测序引物离你的扩增片断太近。 如果不是这种情况,那么可能是你根本没有将扩增片断成功连入。 当然还有一种可能是公司测序送错了结果,把别人的结果送给了你,呵呵。
位卑未敢忘忧国。
10楼2008-07-15 03:44:20
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