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liuli124125

铜虫 (初入文坛)

[交流] 新手测序遇到问题,向各位虫子求助

我在所测得的序列中怎么也找不到下游引物序列,是测序的问题吗还是我的PCR过程出了问题呀。我用的是菌液去测序的,引物是简并引物。问题到底在哪里,我应该怎么去解决呀。向高手们求助了,谢谢。
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xyklmu

至尊木虫 (知名作家)

虫眼看世界

★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+4,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
一般来说,测序反应很少用简并引物的。公司也不愿意接受简并引物去测序,大都是通用引物来测序的,如T3 T7 M13F M13R等。楼主始终未提及,公司是用什么引物测序的,是自己的简并引物还是通用引物?
由于下游引物的方向和测序模板是反向互补的,你可能需要在测序结果的反向互补序列中去找另一个引物。
测序之前是如何验证的?大小与预期相符?
另外,由于是兼并引物(不知道你的简并性有多高?),其在模板上的结合位点就有可能有多个。只要测出来的是你想要的东西,这个时候大可不必介意是否找到引物。
位卑未敢忘忧国。
7楼2008-07-14 01:06:22
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superarm

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
凭我的经验有两种可能
1.你的结果的假阳性,是单引物,就是上游引物扩增的结果
2.DNA片断一部分缺失
与分子生物学的同仁一起遨游科学的海洋!
2楼2008-07-13 00:52:30
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):积极交流奖
测序的问题可能性比较大,换个公司测,或是重测。
活着就要让人感受到你的存在。
3楼2008-07-13 10:09:57
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):谢谢分享,欢迎常来
你是单向测的还是双向测的?如果是单向,也可能是你的插入片段比较长没测通吧?
漫洒英雄泪,相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行?一任俺芒鞋破钵随缘化!
4楼2008-07-13 10:37:41
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