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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » in-fusion连接，农杆菌介导转化真菌，但是第一步做连接时就出问题了
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龙猫龙猫龙猫

新虫 (初入文坛)

[求助] in-fusion连接，农杆菌介导转化真菌，但是第一步做连接时就出问题了 已有3人参与

各位大侠，先说一下我的大体实验。现有目的基因（这个基因本身我们的真菌里就有），和质粒（此质粒里有强启动子）。我们实验的最终目的是希望通过强启动子使这个目的基因高表达。
现在是实验的第一步，就是将目的基因导入质粒中。然后质粒转入农杆菌，再用农杆菌侵染真菌。
第一步之后，拿到重组质粒，想看看目的基因有没有导入进去，就进行了PCR扩增，但是跑胶时出现两条带，800bp和300bp。但是目的基因刚好是1100.
急求各位大侠分析一下，这是什么情况。。。。难道连接时目的基因断了？
另外，农杆菌介导转化之后，与我的真菌侵染，我想加的强启动子，是不是会随机到任何基因前，那不是就没有办法保证高表达我的目的基因了吗。
我是这方面的新手，恳请各位多多指导，谢谢。
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1楼 2015-04-20 17:21:30
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
测个序，啥子问题都看出来了！

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2楼2015-04-20 22:20:41
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我们飞哈

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
龙猫龙猫龙猫: 金币+2, ★有帮助 2015-04-21 15:54:09
你只加了一对引物，是不会正好扩增出分开的两段基因的。如果大小不对，应该就是没有连接上。
关于转化，你没有加同源片段吗？如果没有那肯定是随机突变的。可以在目的基因两段加上同源片段试试。
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3楼2015-04-21 08:43:46
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龙猫龙猫龙猫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by aofeng860308 at 2015-04-20 22:20:41
测个序，啥子问题都看出来了！

现在的问题就在于，测序需要引物，我只能是假设这两段300和800的是我的目的基因，才能用引物。。。好纠结，今天刚送去测序，期待结果吧。。。。谢谢你~
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4楼2015-04-21 15:50:28
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龙猫龙猫龙猫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 我们飞哈 at 2015-04-21 08:43:46
你只加了一对引物，是不会正好扩增出分开的两段基因的。如果大小不对，应该就是没有连接上。
关于转化，你没有加同源片段吗？如果没有那肯定是随机突变的。可以在目的基因两段加上同源片段试试。

首先谢谢你的回复。我在想是不是连接这一步成功了，但是在PCR的时候我的质粒断开了，刚好是在目的基因那断裂的，这样是不是也能扩增出两段呢。因为不确定这300和800是什么，导致引物没法确定，因此测序这条路也行不通了。好纠结。。。。还有，这位老师，请问您说的加同源片段是指？我不是很明白这里，能给我说一下吗，谢谢
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5楼2015-04-21 15:56:38
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 龙猫龙猫龙猫 at 2015-04-21 15:50:28
现在的问题就在于，测序需要引物，我只能是假设这两段300和800的是我的目的基因，才能用引物。。。好纠结，今天刚送去测序，期待结果吧。。。。谢谢你~...

引物用载体上的引物啊，在mcs两端。Infusion的方式理论上不存在基因断裂的情况。

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6楼2015-04-21 17:05:29
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龙猫龙猫龙猫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by aofeng860308 at 2015-04-21 17:05:29
引物用载体上的引物啊，在mcs两端。Infusion的方式理论上不存在基因断裂的情况。
...

已设计载体上引物并测序，谢谢，期待结果中~
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7楼2015-04-22 08:40:56
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 龙猫龙猫龙猫 at 2015-04-21 15:50:28
现在的问题就在于，测序需要引物，我只能是假设这两段300和800的是我的目的基因，才能用引物。。。好纠结，今天刚送去测序，期待结果吧。。。。谢谢你~...

不会把这两条带分别回收装中间载体再测序确认是不是你想要的基因的片段么

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8楼2015-04-24 09:50:39
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