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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » in-fusion连接，农杆菌介导转化真菌，但是第一步做连接时就出问题了
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龙猫龙猫龙猫

新虫 (初入文坛)

[求助] in-fusion连接，农杆菌介导转化真菌，但是第一步做连接时就出问题了 已有3人参与

各位大侠，先说一下我的大体实验。现有目的基因（这个基因本身我们的真菌里就有），和质粒（此质粒里有强启动子）。我们实验的最终目的是希望通过强启动子使这个目的基因高表达。
现在是实验的第一步，就是将目的基因导入质粒中。然后质粒转入农杆菌，再用农杆菌侵染真菌。
第一步之后，拿到重组质粒，想看看目的基因有没有导入进去，就进行了PCR扩增，但是跑胶时出现两条带，800bp和300bp。但是目的基因刚好是1100.
急求各位大侠分析一下，这是什么情况。。。。难道连接时目的基因断了？
另外，农杆菌介导转化之后，与我的真菌侵染，我想加的强启动子，是不是会随机到任何基因前，那不是就没有办法保证高表达我的目的基因了吗。
我是这方面的新手，恳请各位多多指导，谢谢。
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1楼 2015-04-20 17:21:30
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 龙猫龙猫龙猫 at 2015-04-21 15:50:28
现在的问题就在于，测序需要引物，我只能是假设这两段300和800的是我的目的基因，才能用引物。。。好纠结，今天刚送去测序，期待结果吧。。。。谢谢你~...

引物用载体上的引物啊，在mcs两端。Infusion的方式理论上不存在基因断裂的情况。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2015-04-21 17:05:29
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
测个序，啥子问题都看出来了！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2015-04-20 22:20:41
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我们飞哈

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
龙猫龙猫龙猫: 金币+2, ★有帮助 2015-04-21 15:54:09
你只加了一对引物，是不会正好扩增出分开的两段基因的。如果大小不对，应该就是没有连接上。
关于转化，你没有加同源片段吗？如果没有那肯定是随机突变的。可以在目的基因两段加上同源片段试试。
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3楼2015-04-21 08:43:46
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龙猫龙猫龙猫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by aofeng860308 at 2015-04-20 22:20:41
测个序，啥子问题都看出来了！

现在的问题就在于，测序需要引物，我只能是假设这两段300和800的是我的目的基因，才能用引物。。。好纠结，今天刚送去测序，期待结果吧。。。。谢谢你~
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4楼2015-04-21 15:50:28
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