应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » in-fusion连接，农杆菌介导转化真菌，但是第一步做连接时就出问题了
81/1返回列表
查看: 1745  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

龙猫龙猫龙猫

新虫 (初入文坛)

[求助] in-fusion连接，农杆菌介导转化真菌，但是第一步做连接时就出问题了 已有3人参与

各位大侠，先说一下我的大体实验。现有目的基因（这个基因本身我们的真菌里就有），和质粒（此质粒里有强启动子）。我们实验的最终目的是希望通过强启动子使这个目的基因高表达。
现在是实验的第一步，就是将目的基因导入质粒中。然后质粒转入农杆菌，再用农杆菌侵染真菌。
第一步之后，拿到重组质粒，想看看目的基因有没有导入进去，就进行了PCR扩增，但是跑胶时出现两条带，800bp和300bp。但是目的基因刚好是1100.
急求各位大侠分析一下，这是什么情况。。。。难道连接时目的基因断了？
另外，农杆菌介导转化之后，与我的真菌侵染，我想加的强启动子，是不是会随机到任何基因前，那不是就没有办法保证高表达我的目的基因了吗。
我是这方面的新手，恳请各位多多指导，谢谢。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-04-20 17:21:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
测个序，啥子问题都看出来了！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2015-04-20 22:20:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我们飞哈

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
龙猫龙猫龙猫: 金币+2, ★有帮助 2015-04-21 15:54:09
你只加了一对引物，是不会正好扩增出分开的两段基因的。如果大小不对，应该就是没有连接上。
关于转化，你没有加同源片段吗？如果没有那肯定是随机突变的。可以在目的基因两段加上同源片段试试。
赞一下 回复此楼
3楼2015-04-21 08:43:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

龙猫龙猫龙猫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by aofeng860308 at 2015-04-20 22:20:41
测个序，啥子问题都看出来了！

现在的问题就在于，测序需要引物，我只能是假设这两段300和800的是我的目的基因，才能用引物。。。好纠结，今天刚送去测序，期待结果吧。。。。谢谢你~
赞一下 回复此楼
4楼2015-04-21 15:50:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

龙猫龙猫龙猫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 我们飞哈 at 2015-04-21 08:43:46
你只加了一对引物，是不会正好扩增出分开的两段基因的。如果大小不对，应该就是没有连接上。
关于转化，你没有加同源片段吗？如果没有那肯定是随机突变的。可以在目的基因两段加上同源片段试试。

首先谢谢你的回复。我在想是不是连接这一步成功了，但是在PCR的时候我的质粒断开了，刚好是在目的基因那断裂的，这样是不是也能扩增出两段呢。因为不确定这300和800是什么，导致引物没法确定，因此测序这条路也行不通了。好纠结。。。。还有，这位老师，请问您说的加同源片段是指？我不是很明白这里，能给我说一下吗，谢谢
赞一下 回复此楼
5楼2015-04-21 15:56:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 龙猫龙猫龙猫 at 2015-04-21 15:50:28
现在的问题就在于，测序需要引物，我只能是假设这两段300和800的是我的目的基因，才能用引物。。。好纠结，今天刚送去测序，期待结果吧。。。。谢谢你~...

引物用载体上的引物啊，在mcs两端。Infusion的方式理论上不存在基因断裂的情况。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
6楼2015-04-21 17:05:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

龙猫龙猫龙猫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by aofeng860308 at 2015-04-21 17:05:29
引物用载体上的引物啊，在mcs两端。Infusion的方式理论上不存在基因断裂的情况。
...

已设计载体上引物并测序，谢谢，期待结果中~
赞一下 回复此楼
7楼2015-04-22 08:40:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 龙猫龙猫龙猫 at 2015-04-21 15:50:28
现在的问题就在于，测序需要引物，我只能是假设这两段300和800的是我的目的基因，才能用引物。。。好纠结，今天刚送去测序，期待结果吧。。。。谢谢你~...

不会把这两条带分别回收装中间载体再测序确认是不是你想要的基因的片段么

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
8楼2015-04-24 09:50:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 龙猫龙猫龙猫 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-30 10:33 by winsaint
[基金申请] 国社科又开始会评了，不知道这次命运如何 +3 雨打竹帘 2026-08-30 3/150 2026-08-30 09:43 by KNIGHT2011
[基金申请] 29号明天会评吗 +3 笨笨唐 2026-08-28 3/150 2026-08-30 09:29 by cww8181
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 jCd0dEvKHShX 2026-08-29 5/250 2026-08-30 08:33 by ZPa0EcMwuECS
[考博] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 4/200 2026-08-30 07:28 by ZPa0EcMwuECS
[考博] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 5/250 2026-08-30 07:05 by ZPa0EcMwuECS
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 5/250 2026-08-30 06:55 by ZPa0EcMwuECS
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 7/350 2026-08-30 06:46 by ZPa0EcMwuECS
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 8/400 2026-08-30 06:13 by ZPa0EcMwuECS
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-30 06:10 by ZPa0EcMwuECS
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 13/650 2026-08-30 05:38 by ZPa0EcMwuECS
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 5/250 2026-08-30 02:40 by ZPa0EcMwuECS
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +5 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 01:58 by ZPa0EcMwuECS
[博后之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 01:47 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 申请删除本帖 +6 lyz123lyz 2026-08-27 7/350 2026-08-27 17:31 by 宁静致远sy
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭