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巯基活性的测定：简化的巯基试剂（DTNB）法
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巯基活性的测定：简化的巯基试剂（DTNB）法 巯基试剂的配置：称取DTNB 0.0594 g，盐酸胍 0.0172 g，EDTA 0.0112 g 用0.1 mol/L PBS试剂溶解定容至100 mL。 将样品配成100 uL溶液，加入20 uL 1.2 mol/L HCl和400 uL 0.1 mol/L EDTA反应10 min去除金属，加入200 uL巯基试剂，混匀3 min使MT变性后与DTNB形成黄色络合物，用0.1 mol/L PBS pH7.3稀释至6 mL，在412 nm处测紫外吸收值。用C=DA/ε（ε=1.23×104（mol/L）-1•cm-1）测算巯基浓度。 请问 公式C=DA/ε（ε=1.23×104（mol/L）-1•cm-1）中D代表什么 谢谢 |
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测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。 巯基含量的计算公式如下： SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值 D—稀释倍数 C—样品浓度（mg/mL） 问题1：上述公式中稀释倍数D是怎么算的（具体的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 问题2：我测的物质为毛发固体样品，二硫键含量在350μmol/g附近，此种测试方法是否具有可行性 问题3：由于毛发样品中含有非水溶性蛋白，又没哟测量二硫键含量的更好的方法 如解答必重谢 |
3楼2015-10-07 21:23:38