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求高人指点不对称PCR得到的产物是否为单链 已有1人参与
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为了得到单链DNA，做了不对称PCR，模板为双链PCR产物，下游引物浓度为上游引物浓度的1/50。电泳条件为1%普通琼脂糖凝胶，120V电压，EB染色。从左到右依次为4500Marker、gDNA、双链PCR产物、不对称PCR产物、2000Marker。可是从条带位置看不对称PCR产物只比双链PCR产物小一点儿，不像论坛里有人说的单链PCR比双链PCR要小一半左右所出的位置。 请高人指点：我这个不对称PCR得到的产物是单链DNA吗？如果是的话，这个单链出的位置对吗？ ![\"求高人指点不对称PCR得到的产物是否为单链\"](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2015/0325/bw134h3455949_1427236863_554.jpg#opennewwindow\") |
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【答案】应助回帖
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| 不对称PCR有两种方法，第一种，在PCR扩增时，先用等浓度的引物PCR扩增，先得到双链DNA，然后以这双链DNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备单链DNA。第二种方法，用不等量的PCR引物进行扩增，，扩增后产生大量的单链DNA。这对引物分别称为非限制引物和限制引物，他们的比例一般为50-100:1.在PCR扩增的最初10-15个循环中，产物大多为双链DNA，但是当限制性引物消耗完之后，非限制性引物就会产生大量的单链DNA。这就是不对称PCR。不对称PCR的关键就是控制限制性引物的绝对量，这需要经过实验多次摸索优化两条引物的量而最终得到最佳的比例。你现在的方法一次成功是有情可原的，关键是要优化两条引物的量，你现在的这个产物应该不是单链DNA，或者你直接按照第一种方法做。 |
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