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mafang68

金虫 (著名写手)

[求助] HRP标记抗体的非特异性反应 已有3人参与

本人做ELISA试剂盒研发,让别的公司定制的单抗并标记的HRP,现在问题就出在HRP标记抗体的非特异性反应上,先说说实验方法和结果
方法:目的蛋白、非目标蛋白、PBS包被;封闭;加HRP标记抗体反应;显色;检测OD值。

结果:1。与目的蛋白反应很低,OD值在0.2左右;非目标蛋白的反应较高,OD值在0.6左右。(此为同一次实验的检测结果)
2. 复检HRP标记抗体与非目标蛋白反应,OD值仍很高,0.7左右。
3. 另包被PBS,与HRP标记抗体温育,竟然也显色,而且很高,OD值在1.1左右。

以上结果,不知道怎么解释,或是哪步出了问题,与厂家沟通他们也不知怎么回事。希望各位虫友不吝赐教!非常感谢!
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木虫啦,哈哈
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kongxiyang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
mafang68: 金币+5, 有帮助, 谢谢,我的封闭液用的就是BSA蛋白,而抗体稀释液要是加入蛋白俺以前的经验会增大OD值 2015-03-23 16:15:50
在封闭液或者抗体稀释液中加入一些蛋白,看能否消除干扰

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2015-03-21 23:55:27
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hbl215

金虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
mafang68: 金币+10, 谢谢,我挨个试试吧 2015-03-23 16:17:20
可能的问题:封闭时间不够,浓度不够
最可能的问题:HRP标记抗体特异性差,与目标蛋白OD值低是因为形成竞争了,换用其他物种的血清封闭再做一次。

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2015-03-22 08:07:58
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4楼2015-03-22 09:15:12
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haoziying

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
mafang68: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-04-20 09:41:58
1、PBS包被,有信号值,说明整个反应体系污染了,先把包被的所有东西都换掉,再试一次。
2、目的蛋白、非目标蛋白之间的关系,怎么理解有非目标蛋白有反应。
3、要确定定制的单抗筛选的标准,是否与目的蛋白进行反应及反应的亲和力,需要对方再次核实。
4、标记的时候,抗体的结构破坏了,造成非特异反应,
5楼2015-03-24 00:24:10
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kongxiyang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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mafang68: 金币+63, 有帮助, 5 2015-04-20 09:42:14
牛血清代替BSA试一下

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
6楼2015-03-24 22:47:56
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