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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助，110bp左右长的双链DNA用什么方法获得，序列中有重复。
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sunday1234

新虫 (小有名气)

[交流] 求助，110bp左右长的双链DNA用什么方法获得，序列中有重复。 已有4人参与

想获得一段长110bp左右的双链DNA，序列为5‘-CTTTGGTCTCACCAAAACGTTAAATCCGAAACAGAGTCGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAACTTAATCTTAGAACCTTCTGTGTTTTAGAGAGAGACCTTTC-3’，在公司里合成了该双链DNA，但由于连在载体上，需通过酶切回收得到，由于回收困难。所以想通过PCR扩增设计了引物正向：CTTTGGTCTCACCAAAAC反向：gaaaggtctctctctaaac，扩增后不加模板DNA，与加模板DNA都能扩出110bp左右的条带。想请教大家还有什么办法可以直接得到这个长110bp左右的双链DNA。
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1楼 2015-03-03 16:48:11
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
PCR扩不出来就把质粒转到细菌里然后提质粒做酶切吧。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2015-03-03 20:25:04
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一砖头飘死

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-03-07 23:04:51
首先跟你说下我自己做实验中遇到这样的问题的做法，有可能不完整，可以借鉴。

我的方法是这样的：
①首先设计一条完整的110bp的寡核苷酸单链，当做引物合成，这个可以让个引物合成公司完成,Primer1
②设计一段长约20bp的，和110bp寡核苷酸 3端完全互补的一段引物，Primer2
③加入Primer1 and Primer2 94度 5min ，冰上急冷（退火，让两条链结合上去）
③利用 Klenow Fragment DNA聚合酶，就有5到3端的聚合作用（补平粘性末端，形成完整的平末端）
④如果加入了酶切位点可以酶切后，用爱思进的PCR纯化试剂盒回收，记得加一个体积的异丙醇。

希望能帮到你………………
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3楼2015-03-04 08:55:43
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781055707

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-03-07 23:05:13
巢式PCR，在质粒上先设计一段400BP的目片段，再用400P出110。
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2015-03-04 10:22:25
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sunday1234

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 一砖头飘死 at 2015-03-04 08:55:43
首先跟你说下我自己做实验中遇到这样的问题的做法，有可能不完整，可以借鉴。

我的方法是这样的：
①首先设计一条完整的110bp的寡核苷酸单链，当做引物合成，这个可以让个引物合成公司完成,Primer1
②设计一段 ...

谢谢，这个办法挺好的，后期的实验中我们需要很多不同的110bp的序列每次都合成110bp的单链成本有点高，因为,不同的序列的不同之处在于整个序列有40bp碱基不同，需变更的地方用括号标注出。5‘-CTTTGGTCTCACCAAAAC（GTTAAATCCGAAACAGAGTC）GTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAAC（TTAATCTTAGAACCTTCTGT）GTTTTAGAGAGAGACCTTTC-3’，请问您有什么好的办法可以降低成本获得不同的110bp的片段吗
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5楼2015-03-19 14:47:31
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你用MN公司的凝胶回收试剂盒就一点都不困难了，何必PCR呢？

[ 发自小木虫客户端 ]
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6楼2015-03-19 17:28:12
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