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转染HEK293细胞时siRNA与Lipofectamine2000的比例已有3人参与
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最近开始做siRNA转染，遇到了很多问题，但实验室里之前无人做过这方面的实验，特此恳请各位转染大神帮助！ 我要转染的细胞系是转染最常用HEK293细胞，转染体系是6孔板和6 cm皿，目的是要敲低一个分子量300多kD的蛋白质，3条siRNA和Lipofectamine2000均购自Invitrogen公司。 转染前检测了siRNA的量，确定没有降解。EP管和枪头均是无RNA酶的。转染过程中使用的培养基是OPTI-MEM，种细胞及换液用的培养基均为不含青链霉素的10%FBS的MEM培养基，细胞汇合度为80%~90%。 根据Lipo2000说明书的推荐用量（75 pmol siRNA:7.5 uL Lipo2000）、Invitrogen公司网页上针对293细胞的转染protocol（500 pmol siRNA: 5 uL Lipo2000）和之前在丁香园看到的Lipo2000的使用说明（100 pmol siRNA:5 uL Lipo2000）做过尝试，转染6 h后换液，24 h、48 h后通过IF检测目标蛋白的表达（因为实验需要一些荧光照片，鉴于已有抗体的局限性，未对siRNA进行荧光标记），但是都没有达到转染效果。 文献中大多使用的siRNA终浓度为100 nM，在6孔板体系(2.5 mL)中也就是250 pmol siRNA，我试过用5 uL、7.5 uL、12.5 uL Lipo2000去转染，但是也没有作用。到底是siRNA序列不合适还是转染体系不对，我到现在还是云里雾里......而且在6孔板中，每孔Lipo2000的用量上限是多少我也完全搞不清楚......由于我用siRNA干扰后还需要加药物处理细胞，如果转染时细胞量就达90%，再加药物处理就跟平常不干扰时的体系不一样了，担心会有影响，但看了很多帖子都说细胞汇合度对转染效率很重要，到底能不能降低呢？ 恳请各位大神指点，不甚感激！！！！！ |
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siRNA 转染 （权阳生物转载） A．siRNA转染的方法 脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几点 哺乳动物转染的常见方法有：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法（例如,显微注射和基因枪）、阳离子脂质体试剂，其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。 转染试剂的用量 siRNA的用量 转染时的细胞密度 转染时的操作顺序 转染时的操作顺序 细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间 B．Lipofectamin2000 转染试剂 Lipofectamin2000的应用领域 选择最适合的转染试剂和转染条件，往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。 Lipofectamin2000适用于核酸的体内和体外操作，可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染，也可应用于DNA/siRNA 的共转染操作；是一种新型的高效siRNA转染试剂。 原代培养细胞和转化细胞株的基因转染 siRNA高通量转染试验 DNA转染；DNA和siRNA的共转染 核酸（siRNA、DNA、RNA）的体内导入试验 贴壁细胞和悬浮细胞转染 Lipofectamin2000 的特点： 不必更换培养基，操作简便易行，可在半小时内完成操作 在含血清培养基中也能表现高转染效率 细胞毒性低；适用细胞广泛 即用型试剂，可在含有抗生素的完全培养基中转染 基于脂质的转染试剂，确保没有RNAse活性 □ 可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入 C．Lipofectamin2000适用的细胞类型 Lipofectamin2000转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如： HeLa(人颈部癌 细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角 质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺 癌细胞)、CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。 D．转染前细胞培养 在细胞板上培养细胞时，应使细胞汇合在24小时内达到70-90%。 细胞培养用品 表面积（mm2/孔） 细胞密度 培养基（μL /孔） 96孔板 50 1.5´104-5.0´104 100μL 48孔板 100 3.0´104-1.0´105 200μL 24孔板 200 8.0´104-2.0´105 500μL 12孔板 401 1.6´105-4.0´105 1.0 mL 6孔板 962 3.0´105-8.0´105 2.0 mL 35 mm 962 3.0´105-8.0´105 2.0 mL 60 mm 2827 1.0´106-2.5´106 6.0 mL E．合适的lipofectamin2000用量 合适的siRNA(DNA)：lipofetamin2000比例对核酸的高效转染有重要影响；我们推荐的 DNA：lipofetamin2000为1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：lipofectamin2000为 1：0.01-1：0.1（pmol：ul）一般情况下，此范围内都可获得高的转染效率。 细胞培养用品 siRNA/DNA 培养基最终体积 Lipofectamin2000(siRNA/DNA) 96孔板 5pmol/0.2μg 100μL 0.25μl/0.5μl 24孔板 20pmol/0.8μg 500μL 1μl /2μl 12孔板 40 pmol /1.6μg 1 mL 2μl /4μl 6孔板 100 pmol /4.0μg 2 mL 5μl /10μl 35 mm 100 pmol /4.0μg 2 mL 5μl /10μl 60 mm 600 pmol /8.0μg 5 mL 10μl /20μl F．贴壁细胞转染程序 转染前一天，4-5´104细胞接种在24孔板上， 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培养基）细胞培养基。 选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很 2． 选择用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。 重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和两者的比例可在推荐范围内适当调整。 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无血清培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混匀； 混匀lipofectamin试剂，用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl lipofectamin试剂（DNA转染时，则加入2μllipofectamin试剂），轻轻混匀，室温放置5分钟； 将稀释好的siRNA和RNAi-Mate试剂混合；轻柔混匀，室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物。 将100μl siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板板。 7． 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。 G．悬浮细胞转染程序 转染的当天，收集细胞离心，用含FBS的培养基重悬。 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无血清的培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混匀； 混匀lipofectamin试剂，用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl lipofectamin试剂（DNA转染时，则加入2μl lipofectamin试剂），轻轻混匀，室温放置5分钟； 将稀释好的siRNA和lipofectamin试剂混合；轻柔混匀，室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物。 再加入400μL细胞悬浮液（细胞数量决定于细胞类型和转染后分析测试的时间）。 6． 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。 H．DNA和siRNA共转染细胞 在转染的前一天，4-5´104细胞接种在24孔板上，0.5 mL含FBS和抗生素的细胞培养基。 选择用于初期接种的细胞密度，应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。 在100μL的无血清的培养基中稀释20pmol siRNA和0.2μg DNA，加入2μl lipofectamin试剂，充分混合，放置20分钟,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin复合物。 将siRNA/ DNA/lipofectamin复合物加入培养基中，轻轻混匀。 5． 细胞在37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它步骤。 I．siRNA体内导入方法 适量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的无菌水中，轻轻混匀，因为注射液体积有限，建议采用高浓度的siRNA或DNA，一般DNA为2μg /μL、siRNA为10μg /μL。 取适量的DNA、siRNA或siRNA\DNA复合物与lipofectamin混合。例如，在1#管中加入0.5μL的DNA（1μg）和 0.5μL的siRNA（5μg），在2#管中加入0.55μL的lipofectamin（24μg）和0.45μL不含RNA酶的无菌水中，将1#管 中的溶液加入2#管中，在室温下温育30分钟，以形成siRNA/DNA-lipofectamin复合物。 3． 制备的siRNA/DNA-lipofectamine复合物可用于体内导入siRNA、DNA或siRNA\DNA。 |
2楼2015-05-04 01:07:35
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