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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助：扩线粒体基因组全序，中间有一段怎么都扩不出来，不知道还能采取什么方法？
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lxx707

金虫 (小有名气)

[求助] 求助：扩线粒体基因组全序，中间有一段怎么都扩不出来，不知道还能采取什么方法？ 已有5人参与

设计了不下20对引物了，有5对能扩出2000左右的片段，但一般测序不出来。拿去克隆，再测序。再不同公司做了比较，有一段2000bp两个公司做得一样，但是NCBI BLAST无结果。其他三段比对不想似，NCBI上也比不出任何东西。万能的亲们，请多多指教，多给注意，实在是太感谢了！
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1楼 2015-01-28 16:12:46
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logowang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lxx707(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:09:10
一般超过2000长度的，首选Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase。 其扩增效率高，错误率极低，或许能够解决你的问题

关于测序，最好克隆到载体内去测序，测序结果来说，2000bp都什么没比对上很奇怪，你就是乱打的数据都能比对上好多，对于你的描述更多可能是克隆的片段出现问题，并不是你要的东西。

重新在进行克隆测序，会有一些新的提示
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2楼2015-01-28 19:15:28
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zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lxx707(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:09:21
一般两千的序列总能看出是啥东西，能扩出来也说明确定有吧，除非PCR出错。
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永远相信未知的总是美好的！
3楼2015-01-28 21:08:00
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lxx707(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:09:30
我觉得应该是pcr的问题，引物一般克隆岛t载的话都没问题，除非片段不对，有参考线粒体基因组吗。或者在别的物质同源性高不高
一般线粒体都是保守的不会比对不出啥东西
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4楼2015-01-28 21:18:18
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lxx707

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by logowang at 2015-01-28 19:15:28
一般超过2000长度的，首选Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase。 其扩增效率高，错误率极低，或许能够解决你的问题

关于测序，最好克隆到载体内去测序，测序结果来说，2000bp都什么没比对上很奇怪，你就 ...

克隆会出现什么样的问题？不管怎样？现有的数据库是不是应该都能比对到一点？
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5楼2015-08-26 16:23:24
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lxx707

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zshw_001 at 2015-01-28 21:08:00
一般两千的序列总能看出是啥东西，能扩出来也说明确定有吧，除非PCR出错。

每次扩出来的东西很稳定，引物也是在两端设计的，是核基因里面的比对不到吗？
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6楼2015-08-26 16:23:49
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lxx707

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2015-01-28 21:18:18
我觉得应该是pcr的问题，引物一般克隆岛t载的话都没问题，除非片段不对，有参考线粒体基因组吗。或者在别的物质同源性高不高
一般线粒体都是保守的不会比对不出啥东西

您是说PCR有什么问题？
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7楼2015-08-26 16:24:13
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978835147

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-11-17 20:41:35
找到原因了吗？我现在也是这个问题，每次都能扩出来，且很单一，很亮，大小也一致，但是每次测序结果都不是，不管是克隆，还是PCR，且每次的测序结果都不一样。很奇怪啊。
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8楼2015-11-17 19:58:49
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徐官冲123

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也出现过你这个问题，返回来的测序结果blast一下居然没有相似序列，可能上游或者下游序列有问题，产生了错配，虽然能扩出来东西，但是却是假阳性，我的AT值很高，开始用primerstar能扩出来几段，后来说啥也扩不出来了， 换了tks gflex酶就能扩出来了，序列也对，我设计了一大盒引物，换酶后随机拿以前设计的引物都可以扩出来，建议你也试试，祝好。
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9楼2016-02-12 11:32:06
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徐官冲123

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 978835147 at 2015-11-17 19:58:49
找到原因了吗？我现在也是这个问题，每次都能扩出来，且很单一，很亮，大小也一致，但是每次测序结果都不是，不管是克隆，还是PCR，且每次的测序结果都不一样。很奇怪啊。

换酶重新扩，这个可能是假阳性，上下游并没有真正结合在一起
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10楼2016-02-12 11:33:12
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