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lxx707

金虫 (小有名气)

[求助] 求助:扩线粒体基因组全序,中间有一段怎么都扩不出来,不知道还能采取什么方法?已有5人参与

设计了不下20对引物了,有5对能扩出2000左右的片段,但一般测序不出来。拿去克隆,再测序。再不同公司做了比较,有一段2000bp两个公司做得一样,但是NCBI BLAST无结果。其他三段比对不想似,NCBI上也比不出任何东西。万能的亲们,请多多指教,多给注意,实在是太感谢了!
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logowang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lxx707(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:09:10
一般超过2000长度的,首选Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase。 其扩增效率高,错误率极低,或许能够解决你的问题

关于测序,最好克隆到载体内去测序,测序结果来说,2000bp都什么没比对上很奇怪,你就是乱打的数据都能比对上好多,对于你的描述更多可能是克隆的片段出现问题,并不是你要的东西。

重新在进行克隆测序,会有一些新的提示
2楼2015-01-28 19:15:28
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zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
lxx707(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:09:21
一般两千的序列总能看出是啥东西,能扩出来也说明确定有吧,除非PCR出错。
永远相信未知的总是美好的!
3楼2015-01-28 21:08:00
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
lxx707(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-28 22:09:30
我觉得应该是pcr的问题,引物一般克隆岛t载的话都没问题,除非片段不对,有参考线粒体基因组吗。或者在别的物质同源性高不高
一般线粒体都是保守的不会比对不出啥东西
4楼2015-01-28 21:18:18
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lxx707

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by logowang at 2015-01-28 19:15:28
一般超过2000长度的,首选Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase。 其扩增效率高,错误率极低,或许能够解决你的问题

关于测序,最好克隆到载体内去测序,测序结果来说,2000bp都什么没比对上很奇怪,你就 ...

克隆会出现什么样的问题?不管怎样?现有的数据库是不是应该都能比对到一点?
5楼2015-08-26 16:23:24
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lxx707

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zshw_001 at 2015-01-28 21:08:00
一般两千的序列总能看出是啥东西,能扩出来也说明确定有吧,除非PCR出错。

每次扩出来的东西很稳定,引物也是在两端设计的,是核基因里面的比对不到吗?
6楼2015-08-26 16:23:49
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lxx707

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2015-01-28 21:18:18
我觉得应该是pcr的问题,引物一般克隆岛t载的话都没问题,除非片段不对,有参考线粒体基因组吗。或者在别的物质同源性高不高
一般线粒体都是保守的不会比对不出啥东西

您是说PCR有什么问题?
7楼2015-08-26 16:24:13
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978835147

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-11-17 20:41:35
找到原因了吗?我现在也是这个问题,每次都能扩出来,且很单一,很亮,大小也一致,但是每次测序结果都不是,不管是克隆,还是PCR,且每次的测序结果都不一样。很奇怪啊。
8楼2015-11-17 19:58:49
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徐官冲123

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也出现过你这个问题,返回来的测序结果blast一下居然没有相似序列,可能上游或者下游序列有问题,产生了错配,虽然能扩出来东西,但是却是假阳性,我的AT值很高,开始用primerstar能扩出来几段,后来说啥也扩不出来了, 换了tks gflex酶就能扩出来了,序列也对,我设计了一大盒引物,换酶后随机拿以前设计的引物都可以扩出来,建议你也试试,祝好。
9楼2016-02-12 11:32:06
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徐官冲123

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 978835147 at 2015-11-17 19:58:49
找到原因了吗?我现在也是这个问题,每次都能扩出来,且很单一,很亮,大小也一致,但是每次测序结果都不是,不管是克隆,还是PCR,且每次的测序结果都不一样。很奇怪啊。

换酶重新扩,这个可能是假阳性,上下游并没有真正结合在一起
10楼2016-02-12 11:33:12
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