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lxx707

金虫 (小有名气)

[求助] 求助:扩线粒体基因组全序,中间有一段怎么都扩不出来,不知道还能采取什么方法? 已有5人参与

设计了不下20对引物了,有5对能扩出2000左右的片段,但一般测序不出来。拿去克隆,再测序。再不同公司做了比较,有一段2000bp两个公司做得一样,但是NCBI BLAST无结果。其他三段比对不想似,NCBI上也比不出任何东西。万能的亲们,请多多指教,多给注意,实在是太感谢了!
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徐官冲123

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也出现过你这个问题,返回来的测序结果blast一下居然没有相似序列,可能上游或者下游序列有问题,产生了错配,虽然能扩出来东西,但是却是假阳性,我的AT值很高,开始用primerstar能扩出来几段,后来说啥也扩不出来了, 换了tks gflex酶就能扩出来了,序列也对,我设计了一大盒引物,换酶后随机拿以前设计的引物都可以扩出来,建议你也试试,祝好。
9楼2016-02-12 11:32:06
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徐官冲123

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 978835147 at 2015-11-17 19:58:49
找到原因了吗?我现在也是这个问题,每次都能扩出来,且很单一,很亮,大小也一致,但是每次测序结果都不是,不管是克隆,还是PCR,且每次的测序结果都不一样。很奇怪啊。

换酶重新扩,这个可能是假阳性,上下游并没有真正结合在一起
10楼2016-02-12 11:33:12
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