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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重组质粒转到BL21（DE3）中用T7检测没条带，用特异引物检测有条带，怎么回事
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ginnyzhuzhu

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组质粒转到BL21（DE3）中用T7检测没条带，用特异引物检测有条带，怎么回事 已有5人参与

在做原核表达，构建的重组质粒pET-32a-L，双酶切大小正确，重组质粒用T7还有特异性引物检测都正确！但是转化到BL21(DE3)的时候长了满板的菌，挑了十个菌，用T7检测没有一个有条带，但是用特异引物检测都有，到底哪里出了问题？？？？后面换了别人做的感受态转化，结果两个板只长了一颗菌，怎么破？求各位大神指点，小女子不胜感激
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1楼 2015-01-21 10:01:57
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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ginnyzhuzhu: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-01-21 11:09:18
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-21 21:15:36
（用T7检测没有一个有条带，但是用特异引物检测都有），特异引物检测阴性有条带吗？没有的话，应该是连上了，可以提个质粒，双切验证一下，T7的引物坏了也是有可能的。BL21(DE3)这个感受态连上后，我的基本长的都很稀疏。二，三十个菌左右吧。（后面换了别人做的感受态转化，结果两个板只长了一颗菌，怎么破？）妥妥的没连上，有做没酶切的质粒转这个感受态吗？
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采菊东篱下，悠然见南山。
2楼2015-01-21 10:16:13
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ginnyzhuzhu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 781055707 at 2015-01-21 10:34:08
你目的片段多大呀，有400以上吗？...

我的基因的大小是1300bp左右，如果用T7检测的话应该在2000bp左右有条带。空载检测在700bp左右有条带
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8楼2015-01-21 10:40:52
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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ginnyzhuzhu: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-01-21 11:09:29
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-21 21:15:41
做个空白对照，看看空载体会不会跑出条带
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3楼2015-01-21 10:25:07
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ginnyzhuzhu

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by 781055707 at 2015-01-21 10:16:13
（用T7检测没有一个有条带，但是用特异引物检测都有），特异引物检测阴性有条带吗？没有的话，应该是连上了，可以提个质粒，双切验证一下，T7的引物坏了也是有可能的。BL21(DE3)这个感受态连上后，我的基本长的都很 ...

你是说用特异引物检测什么阴性对照啊？我就用了T7/T7ter还有特异性引物检测了挑的菌株，同时也检测了重组质粒！确定T7引物没有问题呀！我觉得构建的重组质粒应该是没问题的啊！现在到最后一步啦~直接提的重组质粒转化到表达菌了
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4楼2015-01-21 10:28:27
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ginnyzhuzhu

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by titus0805 at 2015-01-21 10:25:07
做个空白对照，看看空载体会不会跑出条带

空载用T7跑出条带了！没有用特异引物检测呢，你是说用特异引物检测一下看有没有条带吗
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5楼2015-01-21 10:30:43
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781055707

木虫 (著名写手)
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5楼: Originally posted by ginnyzhuzhu at 2015-01-21 10:30:43
空载用T7跑出条带了！没有用特异引物检测呢，你是说用特异引物检测一下看有没有条带吗...

你目的片段多大呀，有400以上吗？
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采菊东篱下，悠然见南山。
6楼2015-01-21 10:34:08
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titus0805

铁虫 (小有名气)

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5楼: Originally posted by ginnyzhuzhu at 2015-01-21 10:30:43
空载用T7跑出条带了！没有用特异引物检测呢，你是说用特异引物检测一下看有没有条带吗...

是的。不能排除特异引物在后面那个载体里有扩增。另外提质粒双酶切是比较准确的验证方式]
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7楼2015-01-21 10:37:12
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781055707

木虫 (著名写手)
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8楼: Originally posted by ginnyzhuzhu at 2015-01-21 10:40:52
我的基因的大小是1300bp左右，如果用T7检测的话应该在2000bp左右有条带。空载检测在700bp左右有条带...

双切一下吧，在看看结果，转到BL21(DE3)后，你的质粒受到BL21(DE3)自带DNA的影响，估计PET32A(原5900)片段会跑到8000-10000左右。不行，就重做个感受态吧。
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采菊东篱下，悠然见南山。
9楼2015-01-21 10:49:27
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ginnyzhuzhu

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by 781055707 at 2015-01-21 10:49:27
双切一下吧，在看看结果，转到BL21(DE3)后，你的质粒受到BL21(DE3)自带DNA的影响，估计PET32A(原5900)片段会跑到8000-10000左右。不行，就重做个感受态吧。...

重组质粒做了双酶切，正确呀！我再看看BL21上的重组质粒酶切结果？
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10楼2015-01-21 10:55:35
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