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周思远

铁虫 (初入文坛)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 126.3
帖子: 18
在线: 82.8小时
虫号: 2984997
注册: 2014-02-22
专业: 天然有机化学

[求助] 求前辈分析原因关于间接ELISA和双抗夹心ELISA实验的问题

目的是用ELISA检测某种蛋白的含量，间接法步骤
1.板在紫外照射90分钟
2.样品包被:将样品中总蛋白浓度稀释到0.055mg/ml ，0.0275mg/ML ，0.011mg/ML ，0.0055mg/ml ，0.00275mg/ML(用CBS稀释) 4度冰箱过夜
3.在卫生纸上拍掉昨天加的样品
4.每孔加100微PBST 摇床放置5分钟后拍掉清洗液重复3次
5.每孔加2%BSA 100微 37度封闭1小时
6.在卫生纸上拍掉2%BSA
7.每孔加100微PBST 摇床放置5分钟后拍掉清洗液重复3次
8.每孔加一抗 100微（用PBS稀释10000倍） 37度反应1小时
9.在卫生纸上拍掉一抗
10 .每孔加100微PBST 摇床放置5分钟后拍掉清洗液重复3次
11.每孔加二抗 100微（用PBS稀释10000倍） 37度反应1小时
12.在卫生纸上拍掉二抗
13 .每孔加100微PBST 摇床放置5分钟后拍掉清洗液重复3次
14.加pnpp ，每孔100微，37度显色30min
15，加终止液 2M/L NaOH
已经做过两次了但是还是不成线性，显色也不够明显
抗原为细胞中某种蛋白，样品为细胞裂解后的全蛋白，所测浓度也是全蛋白的浓度，不知是样品太稀了还是一抗还是二抗浓度太稀了，裂解方法为37度和零下80度反复冻融
本人本科生，以前也没有做过这类的，希望前辈帮忙分析下原因，还有OD值大概在什么范围内比较合适

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