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不同激发波长测得荧光强度变化怎么是相反的结果的？ 已有1人参与
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激发波长280，测得的蛋白溶液中随加入小分子量增加，荧光强度逐渐降低。在295nm激发波长测量，测得的随加入小分子量增加，荧光强度逐渐增加。为什么会得到完全不同的两种趋势。加入的物质是白藜芦醇，加入量分别是1.25-20ug/ml，蛋白固定浓度是0.5mg/ml，本打算做蛋白被白藜芦醇荧光淬灭，重复了三次得到的也是这么个结果，280nm处随白藜芦醇浓度增加，蛋白荧光减少，295nm激发的，则荧光强度随白藜芦醇增加而增强。并且我也用BSA重复了做发现BSA在280、295nm处激发都是随白藜芦醇浓度增加荧光减弱。求大家给点意见 280nm激发.PNG  295激发.PNG |
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wlhong2010
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
alql: 金币+20 2015-01-19 09:38:23
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alql: 金币+20 2015-01-19 09:38:23
| 280nm处的激发出来的荧光主要为色氨酸和酪氨酸，且主要为色氨酸的，而295nm激发的峰主要为苯丙氨酸的。我觉得出现你那种情况可以理解吧，因为不是所有小分子对蛋白质的峰都有猝灭作用，荧光增强现象也有。考虑小分子与蛋白质作用，会改变蛋白质构象，氨基酸残基的微环境肯定也会发生一定的变化，但不一定要一致吧？！因为构象的改变可能导致某些氨基酸残基的暴露，有的被掩盖，所以出现的结果也会不一样。综上所述，你做出来的这种情况应该不矛盾。（个人意见哈！） |
2楼2015-01-18 14:39:13
3楼2015-01-19 09:38:02
wlhong2010
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好吧，我记错了，295nm处是色氨酸的。先谢谢你的金币哈！你的小分子在295nm处有吸收的话，只能会导致你的荧光量子产率降低啊，而不是增强，所以才要扣內源吸收。我建议你做一个同步荧光吧，得他60nm（激发和发射的间距）出来的荧光光谱完全是色氨酸的，进一步确认下。个人愚见哈！还有就是你的蛋白浓度可以适当高一点，激发出来的峰强一些，结果会更明显点吧，另外就是溶液要稳定，以及反应时间也要一致。4楼2015-01-19 10:29:03
5楼2015-01-20 09:25:27