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关于胰岛素体内样品处理方法已有2人参与
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以下是我在文献中看到的胰岛素体内样品处理方法： A volume of 10ml of plasma sample was pipetted into a 5-ml test tube and diluted to 1 ml with PBS (pH 7.4) to permit sample to be analyzed under the sample conditions. The sample was extracted with 1ml dichloromethane by rotating for 5 min. The tube was centrifuged briefly to separate the layers and then immersed in dry-ice bath. The supernatant layer was decanted and 0.8 ml of the organic phase was transferred toanother tube. To the organic extract 130ml of 0.05 N HCl was added for back-extraction. After shaking and centrifugation the organic layer was evaporated under a stream of nitrogen and a 100-ml aliquot was injected into the HPLC. 取10μl血浆样品加入到5mlEP管中，再加入1mlPBS（7.4），加入1ml二氯甲烷萃取，涡旋5min，简单的离心分层，置于干冰浴中，除去上清液，取0.8ml有机层转移至另一EP管，加入130μl 0.05N HCl反萃取有机层，涡旋和离心后，有机层在氮气流下吹干，取100μl等分样品进样。 问题：1.在该处理方法中，加入7.4PBS、二氯甲烷、0.05HCL的作用分别是什么？ 2.这样提取分离的原理是什么？是根据蛋白质等电点吗还是其他什么？ 3.这样的提取分离方法能将胰岛素与血浆蛋白分离开吗？ 4.是直接吹有机层吗？吹的程度怎么掌握？ 请各位大神给予指点！！！ |
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亲，你真的是很有科研精神啊，180个赞：） 这个是太久远的生物化学的内容啦。胰岛素是小分子蛋白其等电点在5.34-5.45之间，呈弱酸性，PH7.4的磷酸盐缓冲液呈弱碱性，此时不足以使胰岛素的羧基与其提供的正离子成盐，所以胰岛素主要以分子状态存在。非极性的物质在含水的极性环境中存在中时会产生一种相互聚集的力，疏水键或疏水作用力，促使胰岛素分子进入二氯甲烷中。0.05MHCL的PH值应该是在3左右吧，加入强酸使胰岛素分子中氨基的部分与其成盐，胰岛素分子呈离子状态，与二氯甲烷分离进入水相。有机层在氮气流下吹干估计是考虑其收率，你可以试试不吹干和吹干有多大区别。之所以选择等电点附近的PH值，就是因为远离等电点溶解度大，靠近等电点溶解度小。血浆样品中的其他大分子蛋白质在加入盐之后，正如你所说是去水化层沉淀啦，祝你好运！ |
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