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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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小小肥猫

新虫 (小有名气)

[求助] 关于胰岛素体内样品处理方法 已有2人参与

以下是我在文献中看到的胰岛素体内样品处理方法：
   A volume of 10ml of plasma sample was pipetted into a 5-ml test tube and diluted to 1 ml with PBS (pH 7.4) to permit sample to be analyzed under
the sample conditions. The sample was extracted with 1ml dichloromethane by rotating for 5 min. The tube was
centrifuged briefly to separate the layers and then immersed in dry-ice bath. The supernatant layer was decanted and 0.8 ml of the organic phase was transferred toanother tube. To the organic extract 130ml of 0.05 N HCl was added for back-extraction. After shaking and centrifugation the organic layer was evaporated under a stream of nitrogen and a 100-ml aliquot was injected into the HPLC.

      取10μl血浆样品加入到5mlEP管中，再加入1mlPBS（7.4），加入1ml二氯甲烷萃取，涡旋5min，简单的离心分层，置于干冰浴中，除去上清液，取0.8ml有机层转移至另一EP管，加入130μl 0.05N HCl反萃取有机层，涡旋和离心后，有机层在氮气流下吹干，取100μl等分样品进样。
问题：1.在该处理方法中，加入7.4PBS、二氯甲烷、0.05HCL的作用分别是什么？
          2.这样提取分离的原理是什么？是根据蛋白质等电点吗还是其他什么？
          3.这样的提取分离方法能将胰岛素与血浆蛋白分离开吗？
          4.是直接吹有机层吗？吹的程度怎么掌握？
  
       请各位大神给予指点！！！
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1楼 2014-12-02 19:12:43
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yuecen

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小小肥猫 at 2014-12-03 21:24:50
太感谢您的解答！还是有点不明白，胰岛素等电点5.35左右，在PH7.4条件下，它失去水化层，不是呈负离子状态么？加磷酸盐缓冲液属于盐析沉蛋白原理吗？还是什么原理呢？二氯甲烷是有机溶剂，胰岛素怎么进入到有机溶剂 ...

亲，你真的是很有科研精神啊，180个赞：） 这个是太久远的生物化学的内容啦。胰岛素是小分子蛋白其等电点在5.34-5.45之间，呈弱酸性，PH7.4的磷酸盐缓冲液呈弱碱性，此时不足以使胰岛素的羧基与其提供的正离子成盐，所以胰岛素主要以分子状态存在。非极性的物质在含水的极性环境中存在中时会产生一种相互聚集的力，疏水键或疏水作用力，促使胰岛素分子进入二氯甲烷中。0.05MHCL的PH值应该是在3左右吧，加入强酸使胰岛素分子中氨基的部分与其成盐，胰岛素分子呈离子状态，与二氯甲烷分离进入水相。有机层在氮气流下吹干估计是考虑其收率，你可以试试不吹干和吹干有多大区别。之所以选择等电点附近的PH值，就是因为远离等电点溶解度大，靠近等电点溶解度小。血浆样品中的其他大分子蛋白质在加入盐之后，正如你所说是去水化层沉淀啦，祝你好运！
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9楼2014-12-04 09:00:26
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yuecen

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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小小肥猫: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2014-12-04 10:52:24
胰岛素等电点为5.35-5.45，所以采用PH7.4的磷酸盐缓冲液调节血浆样品至中性，使胰岛素呈分子状态，用二氯甲烷萃取，再用0.05HCL反提至水相。个人认为应该能分开，不妨试试，至于有机层要尽量吹干，那个沸点低好吹干，因为要进样的是水相。吹的程度只要不把溶液吹出来就行了，水相是很难吹干的，所以不用担心啦
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2楼2014-12-02 23:12:26
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voyager88

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不同的胰岛素所需溶剂不同，一般回收率都很低，或者存在变性。目前药动学都是使用ELISA的方法测的
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3楼2014-12-03 14:36:19
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小小肥猫

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuecen at 2014-12-02 23:12:26
胰岛素等电点为5.35-5.45，所以采用PH7.4的磷酸盐缓冲液调节血浆样品至中性，使胰岛素呈分子状态，用二氯甲烷萃取，再用0.05HCL反提至水相。个人认为应该能分开，不妨试试，至于有机层要尽量吹干，那个沸点低好吹干 ...

太感谢您的解答！还是有点不明白，胰岛素等电点5.35左右，在PH7.4条件下，它失去水化层，不是呈负离子状态么？加磷酸盐缓冲液属于盐析沉蛋白原理吗？还是什么原理呢？二氯甲烷是有机溶剂，胰岛素怎么进入到有机溶剂层的呢？最后又怎么回到水层的呢？还有二氯甲烷的密度比水大，它在下层，水在上层，直接插到水层下面吹吗？还是要怎么吹呢？每一步都是问题，希望您能帮帮我呀！拜托拜托！
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4楼2014-12-03 21:24:50
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小小肥猫

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by voyager88 at 2014-12-03 14:36:19
不同的胰岛素所需溶剂不同，一般回收率都很低，或者存在变性。目前药动学都是使用ELISA的方法测的

实验室穷呀，只能上液相啊
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5楼2014-12-03 21:27:07
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voyager88

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小小肥猫 at 2014-12-03 21:27:07
实验室穷呀，只能上液相啊...

液相的话检测精度是不够的，至少是液质，而且普通质谱不行，一般四级杆质谱分质量只能到3000，得用傅里叶质谱了。我们以前做过，提取回收率最高也就能到40%，目前基本上所有胰岛素申报项目的血药胰岛素浓度都是Elisa测定的，其实Elisa试剂盒没有你所想那么贵，你查一查文献或者是各胰岛素药品的审评综述，基本都是Elisa，当然也有使用液质测定的，但是很难重复出来，提取回收率都不高，误差比较大
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6楼2014-12-04 08:27:55
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voyager88

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小小肥猫 at 2014-12-03 21:27:07
实验室穷呀，只能上液相啊...

友情提示，胰岛素产品很多，不同胰岛素等电点是不一样的，不但如此，不同胰岛素水溶性、蛋白结合率差异都很大，不能一味地说是多少多少，具体看你的是什么胰岛素。
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7楼2014-12-04 08:32:14
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voyager88

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

其实单用液相，普通的杂峰和胰岛素峰很难分离，干扰很严重，得进质谱二次分离，不但如此内源性和外源性胰岛素很难区分，血浆里有胰岛素酶，样品也不是太稳定，如果你不是做药动学，你就甭考虑如上所说
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8楼2014-12-04 08:39:54
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yuecen

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 小小肥猫 at 2014-12-03 21:24:50
太感谢您的解答！还是有点不明白，胰岛素等电点5.35左右，在PH7.4条件下，它失去水化层，不是呈负离子状态么？加磷酸盐缓冲液属于盐析沉蛋白原理吗？还是什么原理呢？二氯甲烷是有机溶剂，胰岛素怎么进入到有机溶剂 ...

二氯甲烷的密度的确是比水大，你不妨先移取水层，然后再吹干二氯甲烷层，吹干后再将水层加入进去，涡流。
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10楼2014-12-04 09:02:12
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