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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 载体构建
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xzy0425

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体构建 已有4人参与

请问虫友们，在构建重组载体时，拿到原始环状质粒，除了要看酶切位点，还要考虑什么问题？请具体说说，谢谢！！！！！！！！！！！！！！跪求
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1楼 2014-12-02 19:04:55
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coolkid2001

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
xzy0425(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-12-04 19:57:19
引用回帖:
6楼: Originally posted by xzy0425 at 2014-12-03 19:00:20
很多书上给的质粒图谱除了质粒名称、质粒大小、抗性编码区、一些表示位置的数字外，就差不多就剩酶切位点分布了，我不知道该怎么做？不知道下一步到底该先做什么，该如何完成实验？跪求详细说明啊: ...

不是去找书，而是要去仔细阅读你想使用的那个载体的厂家说明书。有时厂家会给一个简短版本的说明，内有载体图谱，抗性，酶切位点，质粒骨架主要构成等，这些信息对于熟手来说，足够了（例如GE公司的pGEX系列）。但是除此以外，还会有一个比较详细的操作说明叫"Manual"或者"protocol"，可以去质粒生产厂家的官方网站下载，或者用谷歌搜索到，里面会有很详细的信息，甚至包括质粒构建，转化，保种等一系列操作信息，一般是英文版本。楼主如果真要做好实验，请务必好好学习这个说明书，特别是没有师兄或者师姐教你的时候，恕我直言，光靠论坛上大家的解释，还是可能会有疏漏的。
2. 首先看看这个载体是不是你所需要的，例如是真核、还是原核。
3. 看看是什么启动子，你所选的宿主或者表达菌株（细胞）是否有相应的转录因子识别这个启动子
4. 看看是什么抗性，这个和质粒扩增，重组子或稳定株筛选有关
5. 看看有什么酶切位点，你需要用软件分析你要插入的DNA的序列，最后选定使用的酶切位点不能出现在你的插入基因序列中。
6. 看看还有什么其他注意事项。
7. 大家补充……
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一入江湖岁月催
9楼2014-12-03 21:32:16
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wushm388

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by coolkid2001 at 2014-12-03 21:32:16
不是去找书，而是要去仔细阅读你想使用的那个载体的厂家说明书。有时厂家会给一个简短版本的说明，内有载体图谱，抗性，酶切位点，质粒骨架主要构成等，这些信息对于熟手来说，足够了（例如GE公司的pGEX系列）。但 ...

讲的很不错。
补充一下：7. 分泌表达还是胞内表达？
8. 带标签吗？是何标签。
正如楼上几位所述，对于熟手来说，有质粒图的信息就足够了，新手的话，找一个内行人指点指点，很快就能入门的，并不很难。告诉人家你要表达什么基因？目的是什么？等等，内行人指点指点，你就都明白了。
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10楼2014-12-04 09:40:39
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xzy0425: 金币+1, ★有帮助 2014-12-04 19:25:15
看是否有标签，结合你的实验目的看需要如何设计实验

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-12-02 19:23:06
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coolkid2001

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xzy0425: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-12-04 19:25:44
载体抗性。
另外，像pcDNA3.1这种真核表达载体，如果基因起始位置满足kozak序列规则，蛋白翻译效率会显著提高。
每个载体都有其说明书的，建议楼主仔细阅读。
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一入江湖岁月催
3楼2014-12-02 21:46:05
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wushm388

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xzy0425: 金币+1, ★有帮助 2014-12-04 19:26:01
质粒图，最好有目的基因序列。用之前双酶切实验检验，然后就可以进行后续实验了。
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4楼2014-12-03 14:26:59
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xzy0425

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuguiyan at 2014-12-02 19:23:06
看是否有标签，结合你的实验目的看需要如何设计实验

什么是标签？象开放阅读区、起始位点什么的需要考虑吗？
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5楼2014-12-03 18:52:29
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xzy0425

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by coolkid2001 at 2014-12-02 21:46:05
载体抗性。
另外，像pcDNA3.1这种真核表达载体，如果基因起始位置满足kozak序列规则，蛋白翻译效率会显著提高。
每个载体都有其说明书的，建议楼主仔细阅读。

很多书上给的质粒图谱除了质粒名称、质粒大小、抗性编码区、一些表示位置的数字外，就差不多就剩酶切位点分布了，我不知道该怎么做？不知道下一步到底该先做什么，该如何完成实验？跪求详细说明啊
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6楼2014-12-03 19:00:20
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xzy0425

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wushm388 at 2014-12-03 14:26:59
质粒图，最好有目的基因序列。用之前双酶切实验检验，然后就可以进行后续实验了。

请看一下我在楼上的回复，有这么简单吗？帮帮忙，否则我都不敢面见老板了
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7楼2014-12-03 19:02:26
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cory0931

至尊木虫 (文坛精英)

巫山云
引用回帖:
6楼: Originally posted by xzy0425 at 2014-12-03 19:00:20
很多书上给的质粒图谱除了质粒名称、质粒大小、抗性编码区、一些表示位置的数字外，就差不多就剩酶切位点分布了，我不知道该怎么做？不知道下一步到底该先做什么，该如何完成实验？跪求详细说明啊: ...

身边找一个会的学长，让好好给你带带；
基础理论清楚了，事情会变的简单起来；
自己也多看看资料多想想，没做过的事，总会显得很难，做着做着也就没什么了；
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锤之千古
8楼2014-12-03 20:29:33
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