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dongningdz金虫 (小有名气)
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3楼2014-11-28 00:22:53
dujianmin
新虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
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α基因诱导机制不同于IFNβ基因,由此提出了 IFN基因的两步诱导模型[9]。IFN生成的正反馈 调节机制的存在,保证了IFN的有效释放。IFN β基因首先通过IRF3的病毒诱导活化而表达, 然后IFNα基因被ISGF3诱导。 3 IFN基因工程 1980年,Derynck、Taniguchi和Weissmann等 科学家克隆了人IFN基因;1981年Goeddel报道 IFNγ基因克隆成功。1982年Deuager等根据人 IFN氨基酸顺序,首先由人工合成了IFN基因,并 克隆成功。 天然的IFNα含有由21个氨基酸残基组成 的信号肽,因此在大肠杆菌中构建表达型重组质粒 时,必须去除相应的信号肽编码序列,然后将成熟 结构蛋白基因与大肠杆菌的某一基因重组以表达 融合蛋白。α1型IFN与IFNα由于分子中含有 一个游离的半胱氨酸巯基,在利用大肠杆菌重组表 达时,容易形成分子间二硫键交联而产生相应的寡 聚体,降低其生物活性。除了大肠杆菌外,各型 IFN基因已在枯草芽孢杆菌、链霉菌以及酵母菌中 获得高效表达。 1998年,Manuel Rodriguez和Vladimir Mar- tinez等报道在毕氏酵母中高水平表达牛IFNω1 基因。编码bIFNω1的基因采用PCR方法从牛 染色体组DNA中分离,重组bIFNω1在毕氏酵 母中表达,并有高水平重组蛋白分泌到培养基中。 获得的bIFNω1在抗病毒活性方面不表现种族 特异性。bIFNω1基因为600 bp片段,被克隆到 pPS7表达载体NcoI位点,形成pPBI载体,受毕氏 酵母pAOX1增强子调控。bIFNω1基因在培养 基中由蔗糖转化酵素信号肽高效诱导表达。以前, 其它异源蛋白也被毕氏酵母高水平表达过,将这一 分泌信号应用于pPS7载体中,有利于异源蛋白在 毕氏酵母中表达[10]。 4 IFN与基因治疗 IFN具有显著的抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖及 免疫调节等生物活性。肿瘤作为一种分子病,发病 机制是由于癌基因及抑癌基因的突变所致,因此基 因治疗是战胜肿瘤的一种重要手段。IFN有望应 用于肿瘤的基因治疗。将IFNγ基因借助于逆 转录病毒载体导入到抗原性很弱的小鼠纤维肉瘤 CMS 5细胞系中,使其分泌足够量的IFNγ。 实验证实,由于IFNγ能使CMS5细胞的MH- CI类抗原表达增强,于是具有转基因CMS5细胞 的小鼠便产生了对CMS5特异、持久、由杀伤T淋 巴细胞(CTL)介导的保护性免疫应答反应。CTL能 对肿瘤细胞产生免疫应答反应,识别并杀伤肿瘤细 胞。 虽然细胞因子基因工程产品已开始应用于临 床,但存在的一个突出问题是这些细胞因子在体内 的半衰期都很短,若要达到治疗水平,必须持续大 剂量注射,由此会产生一系列副作用。基因疗法提 供了一种较为理想的给药方式,使血液中细胞因子 的水平稳定地维持在疗效范围内,尤其在靶部位保 持特异性高浓度。用脂质体包埋含有人IFNγ 基因的真核表达质粒,并在其表面嵌入能识别人胶 质瘤的单克隆抗体,这种脂质体进入体内后,特异 性地与胶质瘤细胞发生融合,在此过程中同时将 IFNγ基因导入肿瘤细胞,定位表达的IFNγ 便抑制其增殖。 5 展望 在干扰素研究中,还有一些理论与实践方面的 问题需要进一步探讨。第一,不同来源干扰素组织 亲和性与生物学作用有待进一步了解。干扰素种 类较多,而且具有多种亚型,它们的生物学功能仍 需要更深入了解。第二,干扰素的分子结构需要深 入研究,并要从多种角度对其进行改造,从而更有 效地发挥其生物功能,并赋予新的功能。第三,重 组干扰素不能大量生产,生产成本太高限制了其广 泛应用。我们应该探索更有效的基因表达体系,以 能高水平表达干扰素基因。第四,干扰素的提纯和 测定方法尚不够稳定和简化,影响了干扰素的作 用效果,这方面也需进一步改进。 干扰素具有广阔的应用前景,利用基因工程技 术生产重组干扰素产品具有很好的临床效果。干 扰素治疗一般无严重副作用,主要用于临床肿瘤、 病毒性感染等的治疗,如慢性乙肝、丙肝、病毒性角 膜炎等。在畜牧业中,干扰素应用广泛,其制剂可 用于预防与治疗多种动物疾病,尤其是对流感、新 城疫等病毒感染具有较好的防治效果。此外,干扰 素可以采用药物控释技术制作成胶囊或者纳米粒 子,与适宜载体结合,作为保健型饲料药物添加剂 使用。 参考文献 [1]Campbell Lain,LK Thomas.Structural and functional neuropath- ·24·中国兽药杂志 2003,37(6):22～25/亓立峰,等 子2～4分别编码23、60、40个氨基酸,外显子4也 编码终止子与3'UTR,外显子2与4的氨基酸序 列具有高度保守性,分别为56.5%与42.5%。三 个内含子准确插入两个密码子之间的开放阅读框。 内含子都具有保守性序列,包括5'GT与3'AG。 尽管氨基酸序列存在差异,但I型IFN具有 相似的三维结构,都由紧密排列的α螺旋结构域构 成,并表现出相似的生理、生化特征,如对pH的稳 定性和对同类细胞表面受体的识别。IFNγ是一 同型二聚体,每一个原体细胞中含有与IFNβ排 列相似的螺旋区,它的细胞表面结合受体也不同于 Ⅰ型IFN[2]。IFNα1型分子中含有5个半胱氨 酸的残基,形成2对二硫键,分别为Cys1Cys98 和Cys29Cys138,第85位上半胱氨酸的巯基游 离。α2型IFN在第85位不是半胱氨酸,而是酪氨 酸,它所形成的二硫键与α1型完全相同。IFNβ 分子中含有3个半胱氨酸残基,其中能形成二硫键 的是Cys31Cys141,它与IFNα的Cys29 Cys138结构同源,第17位的半胱氨酸巯基游离。 IFNγ不含半胱氨酸,在第25位和第97位的 Asn处有两个N糖基化位点。 2 IFN及其基因表达 2.1 IFN启动子与IFN表达调控 IFN的表达 受多种转录因子、细胞因子及调控元件的调节。如 白细胞介素、IFN调控因子(IRF)、细胞分裂素等。 IFN的表达调控主要在转录水平。IFN基因启动 子、内含子及3'UTR中都存在一些潜在的调控序 列。哺乳动物中,许多重要的IFN转录调控元件 位于转录起始点第一个150 bp上游区。这些调控 元件包括TATAATA与CCATbox。启动子区 也包含一个潜在的NFkB家族结合位点。Penix 等在人的IFNγ基因启动子中发现了两个必需 的调控元件,它们也存在于其它哺乳动物IFNγ 基因启动子中。末端保守元件包含一个相同的反 向GATA位点与一个潜在的调节位点,它存在于 含有CCATbox的GMCSF与MIP基因的启 动子区[3]。 2.2 IFN激活基因的表达 IFN促进基因表达以 发挥生物活性。由信号介质和转录激活物(signal transducers and activators of transcription,STATs) STAT1、STAT2、p48组成的复合转录因子是一种 DNA结合蛋白,称为IFN激活的基因因子3(IFN stimulated gene factor 3,ISGF3),它调控IFNα/ β激活基因的表达。与IFNγ相比,IFNα/β需 要高剂量诱导p48启动子,IFNα/β通过IFNα 诱导因子活化调控GATE(IFNγ活化转录因子) 依赖基因的表达,IFNγ诱导两个IFNγ诱导 因子结合到GATE上,IFNγ是GATE依赖基因 的强诱导物[4]。 IFN通过与细胞因子受体跨膜蛋白细胞外区 域相互作用,激发靶细胞信号传导。这些受体不能 识别细胞质感受器区域,它们特异性地与细胞质 JAK家族蛋白质酪氨酸激酶相互作用。STAT中 的特异酪氨酸残基被JAKs磷酸化激活后,与磷酸 化酪氨酸的Src同源区2(SH2)相互作用形成同体 和异体二聚体(STAT二聚体),结合到基因的γ 激活序列(gamaactivated sequence,GAS)上激活 基因的表达。不同的GAS与不同的STAT二聚体 建立特异性反应。复合转录因子(ISGF3)同一个 结构上与GAS迥然不同的IFN激活的调节序列 (IFN stimulated regulated elements,ISREs)结合。 ISREs促进多数IFNα/β调控的基因与少数IFN γ调控的基因的表达。含ISREs序列的基因也能 被ISGF3独立诱导,大部分通过IRF1的作 用[5]。 2.3 转录因子诱导IFN基因表达 在IFN调控 因子家族中,IRF3参与病毒诱导IFNβ基因的 表达,另一成员IRF7对于IFNα基因诱导起 重要作用,IRF7参与病毒诱导细胞核内转位, IRF 7异常表达能够诱导IFNα基因表达。这 些结果表明IRF7是IFNα/β正反馈调控中的 主要因子[6]。 IFN调控因子3(IRF3)与调控因子7(IRF 7)在活化I型IFN基因表达与诱导抗病毒活性中 发挥重要作用,转录因子具有相同的结构、功能特 征及共同的碳端磷酸化活化机制,IRF3、IRF 7 活化过程中具有相似的信号转导途径。IRF3、 IRF 7能选择性调控I型IFN与IFN激活基因 (ISG)的表达[7]。转录因子家族中IRF参与IFN 系统调控,IRF1与p48对于IFN介导抗病毒应 答非常重要,p48是ISGF3的必要组成。最近研究 表明IRF家族中另一成员IRF3在病毒诱导 IFNβ基因活化中起重要作用。事实上,IRF3 存在于正常细胞的细胞质中,在感染病毒细胞中, 它被磷酸化并转位到细胞核内,活化的IRF3与 CBP/p300共同促进IFNβ启动子转录[8]。IFN ·23· 2003,37(6):22～25/亓立峰,等 中国兽药杂志 干扰素的分子生物学研究进展 亓立峰,许梓荣 (浙江大学饲料科学研究所,教育部动物分子营养学重点实验室,浙江杭州 310029) [收稿日期]2002 12 26 [文献标识码]A [文章编号]1002 1280(2003)06 0022 04 [中图分类号]R979.5 [摘 要] 干扰素是一类多功能细胞因子,是由哺乳动物体细胞合成与分泌的潜在的生物活性 蛋白质,具有抵抗病毒感染、抑制肿瘤细胞生长与调节机体免疫功能的作用,其基因表达受多种 因素和调控元件的调节。干扰素基因工程和基因治疗研究引起了广泛的关注,目前已被应用于 临床治疗。 [关键词] 干扰素(IFN);基因表达;基因工程 亓立峰(1978年～),男,博士研究生,动物营养与饲料科学专业,研究方向为动物分子营养学。 干扰素(IFN)是多功能细胞因子家族中的一 员。1957年,Isaacs和Lindenmann利用鸡胚绒毛 尿囊膜研究流感干扰现象时发现受病毒感染的细 胞能产生一种因子,作用于其它细胞时能干扰感染 病毒的复制,因而将其命名为IFN。目前已知IFN 是一类高活性的多功能糖蛋白。IFN基因核酸序 列分析结果表明,它于5～l0亿年前即存在于生物 细胞中,是生物体内一类古老的保护因子。IFN在 抗病毒性疾病和恶性肿瘤以及增强机体免疫调节 能力方面有明显效果,其抗病毒活性是由细胞受体 介导并依赖于信号途径的激活、特异基因产物的表 达及抗病毒机制的特性。IFN通过与细胞膜上的 特异性受体结合,诱导靶细胞产生特异性功能蛋 白,如蛋白激酶和2'5'寡聚腺苷酸合成酶,进而 引发级联性的信号放大过程,将信号最后传递到细 胞核内,对一系列基因的表达进行调控,并引发各 种生理反应[1]。IFN其它活性包括抑制细胞增殖、 调节功能性细胞活性及对细胞分化与免疫的调控。 IFN通过增强巨噬细胞的吞噬活性及淋巴细胞对 靶细胞的特殊细胞毒性,起到免疫调节作用。随着 分子生物学、DNA重组技术的不断发展,利用基因 工程技术生产重组IFN,已成为研究的重要内容。 1 IFN分类与分子结构 1.1 IFN分类 IFN的来源因动物种类、细胞类 型、诱生剂的性质和诱生条件而异,可分为来自白 细胞的IFNα,来自纤维母细胞的IFNβ和来自 淋巴细胞的IFNγ。IFNω也属于白细胞源 IFN,IFNκ是一新型的纤维细胞源IFN。其中, 耐酸的IFNα、IFNβ、IFNω与IFNκ又合称 为I型IFN;对酸敏感的IFNγ称为Ⅱ型IFN或 免疫IFN。IFNα存在多种结构序列不同的亚 型,分别命名为α1、α2、α3等,目前已经鉴定的IFN α亚型至少有23种之多。由病毒、微生物及其产 物诱导产生的I型IFN主要参与抗病毒、抗肿瘤 活性,如诱导合成抗病毒蛋白、2'5'腺苷酸合成 酶;由淋巴细胞受有丝分裂原或特异抗原刺激产生 的Ⅱ型IFN主要参与诱导MHC类抗原的表达和 免疫调节效应,但其抗病毒作用比I型IFN弱。 1.2 IFN的分子结构 IFN具有广谱诱导抗病毒 活性。白细胞IFNα的各亚型均含165～166个 氨基酸残基,结构相似;IFNβ含166个氨基酸残 基;IFNω含172～174个氨基酸残基。不同类型 IFN分子具有不同程度的氨基酸同源性(IFNα 与IFNβ分子同源性为28%,与IFNω分子同 源性高达60%)。IFNα与IFNβ的结构基因 均定位于人的第九号染色体上,而且都不含有内含 子。IFNγ基因定位于第12号染色体上,共含有 3个内含子。目前已鉴定出的IFNα非等位基因 至少有15个,而IFNβ和IFNγ均由单基因编 码。动物IFNγ基因4个外显子编码数目相近 的氨基酸。第一个外显子包含5'UTR、19个氨基 酸的信号序列和22个氨基酸的成熟蛋白质。外显 ·22·中国兽药杂志 2003,37(6):22～25/亓立峰,等 ology in transgenic mice with CNS expression of IFN-α[J].Brain Research,1999,835(1):46-61. [2]Anthony Meager.Biological assays for Interferons[J].Journal of Immunological Methods,2002,261:21-36. [3]Pete Kaiser,Hester M Wain,Lisa Rothwell.Structure of the chicken interferon-γgene,and comparison to mammalian homo- logues[J].Gene,1998,207:25-32. [4]Xiao Weihua,Wang Ling.Regulation of interferon-α/β-stimulated gene expression through the gamma-activated transcriptional element[J].Antiviral Research,1999,40:145-153. [5]David ELevy,Adolfo Garcia-Sastre.The virus battles:IFN in- duction of the antiviral state and mechanisms of viral evasion[J]. Cytokine&Growth Factor Reviews,2001,12:143-156. [6]Mitsuharu Sato,Naoki Hata.Positive feedback regulation of type I IFN genesby the IFN-inducible transcription factor IRF-7[J]. FEBS Letters,1998,441:106-110. [7]Servant MJ,Tenoever B.Overlapping and distinct mechanisms regulating IRF-3 and IRF-7 function[J].Journal of Interferon and Cytokine Research,2002,22(1):49-58. [8]Nguyen,Hannah,Hiscot John.The growing family of interferon regulatory factors[J].Cytokine&Growth Factor Reviews, 2001,8(2-3):133-142. [9]Eason Donna,D Shepherd,Alexander T.Interferon regulatory factor 1 tryptophan 11 to arginine point mutation abolishes DNA binding[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)/Gene Structure and Expression,1999,1446(1-2):140-144. [10]Manuel Rodriguez,Vladimir Martinez.The bovine IFN-ω1 is biologically active and secreted at high levels in the yeast Pichia pastoris[J].Journal of Biotechnology,1998,60:3-14. The molecular biological research of interferons QI Li-feng,XU Zi-rong (Feed Science Institute ofZhejiang University,The Education MinistryKey LaboratoryofAnimal Molecular Nutrition,Hangzhou,Zhejiang310029;China) Abstract:Belong to a kind of multifunctional cytokines,interferons are potent biologically active proteins synthesized and secreted by somatic cells of all mammalian species.Interferons'biological activities include antiviral activity,inhibition of cell proliferation,regulation of cellular differentiation and immunomodulation. Gene expression of interferons is regulated by various factors and regulatory elements.Interferons have been applied to disease diagnoses.And people have paid more attention to interferons'gene engineering and gene therapy. Key words:interferons;gene expression;gene engineering 农业部疫源调查组:人类SARS病毒可能来自野生动物 我国SARS病毒起源研究工作取得突破,专家们已从蝙蝠、猴、果子狸以及蛇等数种动物体内检测到冠状病毒基因,已 测出的病毒基因序列与SARS病毒的基因序列完全一致。 据了解,农业部和广东省联合组织了科技攻关小组,在广东省率先开展SARS病毒疫源调查工作。调查组由中国农业 科学院哈尔滨兽医研究所、解放军军需大学、华南农业大学和广东省动物防疫监督总所、广东省疾病预防控制中心等兽医、 卫生单位的专家组成。目前已采集59种动物共计1700头(只)份动物样品。调查组认为,SARS病毒或类SARS冠状病毒 可能存在于若干野生动物体内。病毒的系统详细鉴定以及动物中的SARS病毒或类SARS冠状病毒是如何引起人类发病 等问题,正在进一步研究中。 深圳与香港合作发现人类SARS病毒来自野生动物。 深圳市疾病预防控制中心与香港大学微生物学系、深圳动物防疫监督所、深圳市野生动植物保护站联合组成攻关小 组。攻关小组从6只果子狸标本中分离到3株SARS样病毒;对其中1株进行基因全序列测定,结果显示:果子狸SARS样 病毒与人类SARS病毒有99%以上的同源性。进一步的基因分析,证明了动物SARS样病毒是人类SARS病毒的前体。同 时,在对10名野生动物经营者进行的SARS病毒抗体检测分析中,5人呈阳性反应,提示野生动物体内存在的SARS样病 毒可能也感染密切接触者。 这项研究成果为进一步阐明人类SARS的源头及传播链提供了重要证据,也为下一步研制SARS病毒疫苗、防治药物 等提供了技术支持。 (《人民日报》2003年05月24日第二版) ·25· 2003,37(6):22～25/亓立峰,等 中国兽药杂志 |
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