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xlx906047684

金虫 (著名写手)

[求助] 引物设计 已有7人参与

导师按照文献给我设计了两对引物,但PCR的结果和文献完全不一样,文献上得到的是1100bp左右的条带,我得到得的是300bp左右的条带,而且提DNA和PCR都重复做了,结果一样,导师说要重新设计引物,但我不知道怎么在NCBI上找到该物种中发现的所有这个基因相关序列,也不知道该怎么设计引物,本人是跨专业做分子,所以好多东西还不太懂,希望大家能帮帮忙
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意萧02

木虫 (正式写手)

感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2014-11-25 13:11:02
就说说而已,怎么帮,序列都没有,跟没说一样
3楼2014-11-25 09:57:59
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utryer

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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xlx906047684: 金币+2, 有帮助 2014-11-25 21:33:52
ncbi上有一个primer-blast程序,运行一下就全明白了,再者,文献中的引物千万不可全信。
8楼2014-11-25 20:38:31
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utryer

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by xlx906047684 at 2014-11-25 21:33:38
这么简单吗,能不能说的具体点啊,我之前学的化学,现在才开始做分子,好多还不太懂,谢谢帮忙啊...

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
1.在引物处输入你的正向引物和反向引物,
2.Database选择你要查询的数据库
3.Organism你的物种,
然后查询,
理论上来说,结果会出了n条。看看里面有没有你所要的片断长度及实际扩出来的长度。
11楼2014-11-26 01:03:45
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mizhoulong

木虫 (著名写手)

环境卫生、微生物学

【答案】应助回帖


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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-27 20:06:23
哪有想的那么麻烦,这个原则,那个原则
http://www.simgene.com/Primer3
用了很多次,从排名前5的里边选靠前的,基本没问题
环境卫生、微生物学、卫生应急
12楼2014-11-26 09:36:49
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gufeng2008

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-27 20:06:32
Left primer is Tm too low/High end self complementarity; Right primer is Tm too low。下面引物试试看行不行:
LEFT   aaacccattcgatcgatcattagta
RIGHT  tgtggaggaaactcacaattattca
PRODUCT SIZE: 1367.
14楼2014-11-26 10:49:28
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普通回帖

zhenxiangkai

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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xlx906047684: 金币+2, 有帮助 2014-11-25 20:33:08
引物设计其实很简单,就是要你基因的两端,5-3端,我们只要把5端的20个左右就可以了,当然,需要的时候可以加些酶切位点,保护碱基之类的,很简单的。主要我做的是做普通的那种
2楼2014-11-25 08:30:50
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意萧02

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
xlx906047684: 金币+2, 有帮助 2014-11-25 20:52:13
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhenxiangkai at 2014-11-25 08:30:50
引物设计其实很简单,就是要你基因的两端,5-3端,我们只要把5端的20个左右就可以了,当然,需要的时候可以加些酶切位点,保护碱基之类的,很简单的。主要我做的是做普通的那种

5'端就是个定位定点作用,关键是3‘端的设计好吗?
4楼2014-11-25 09:59:43
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zhenxiangkai

金虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 意萧02 at 2014-11-25 09:59:43
5'端就是个定位定点作用,关键是3‘端的设计好吗?...

你自己看看哦 你要怎么设计?
5楼2014-11-25 12:17:59
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xlx906047684

金虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 意萧02 at 2014-11-25 09:57:59
就说说而已,怎么帮,序列都没有,跟没说一样

1 gaaaacccat tcgatcgatc attagtactt ccaactaaac tagcaagcta gtgagagatg
       61 gcagcttcaa ctgaagagat gacgaaggca ctaacagccg ccaccgtcct ggccatcggc
      121 acggccaatc ctcccaattg ctactaccaa gctgactttc ccgacttcta cttccgcgcc
      181 accaacagcg accacctcac ccacctcaag cacaaattca agcgcatttg tgagaagtca
      241 atgatcgaga agcgttacct tcaattgacg gaagacattc tcaaagaaaa cccgaatatc
      301 ggtgcgtacg aggcaccatc attggatgta agacacgaaa ttcaagtgaa aggagttgca
      361 cagcttggga aagaggccgc tctcaaggcc atgcaagagt ggggccaacc caaatctaag
      421 atcacacatc tcatcgtgtg ttgcatagcc ggggttgaca tgccaggcgc agattatcaa
      481 ctcactaagc ttcttgacct aaactcttct gttaagcgct tcatgtttta ccacctagga
      541 tgttacgctg gtggcaccgt ccttcgtctt gccaaggata tagccgagaa caacaaagga
      601 gctcgtgttc tcatagtttg ttcagagatg acgccaatct gcttccgtgg gccatctgaa
      661 acccatatag actccatggt agggcaagca atatttggtg atggtgctgc agctgtcata
      721 gttggagcga acccagacct aacagttgag aagcccattt tcgagttgat ttccacagcc
      781 caaactatca tacctgaatc tgatggtgcg attgagggcc atttgctaga agttggactc
      841 agtttccaac tctaccagaa tgtccccgca ctaatctcta atagcatagg aacatgcctt
      901 tcagaagctt tcacccctct aaacattagc aattggaact ccctcttctg gatcgcacat
      961 cctggtggcc ctgctatcct agaccatgtt gaggccaccg ttggtctcaa caaggagaaa
     1021 cttaaggcaa ccagacaagt gctgaacgac tatggaaaca tgtcaagtgc ttgtgtgttt
     1081 tttatcatgg atgagatgag gaagaagtca cttgaaaacg gccacgcaac gactggagaa
     1141 ggactgcagt ggggcgttct gtttggattc gggcctggta ttactgttga aactgtggtg
     1201 ctacgaagtg tgcccatcat ttaactcaaa atgattgaat cacgtacttc caattagtaa
     1261 tatatgttca tccttctgta tcggtagagt tgatctgatg tctttgtgtt ttctttatta
     1321 ttgagccctt ttgatcatgt accctgaata attgtgagtt tcctccacaa tgggaacgct
     1381 tgtatgatag cattttcaat ttaaagaata acattatatt cgatctcc
其中第57bp到1224bp是编码区
这是根据文献上的序列号查到的序列,导师给我设计了两对引物
第一对是F:atggcagcttcaactgaag   R:ttaaatgatgggcacacttc
第二对是F:gatggcagcttcaactgaag   R:atgatgggcacacttcgtag
第一对引物和文献上的是一样的,只是没有加文献上5端的酶切位点和保护碱基,但扩增出来的条带比文献上端好多,文献上是1137bp,但我得到的亮带只有300bp左右,而且两对引物得到的结果完全不一样,第二对在300bp除几乎看不到条带,两对引物几乎是一样的但结果完全不一样,麻烦帮我分析一下,如果重新设计引物怎么设计啊,谢谢啊
6楼2014-11-25 20:27:07
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xlx906047684

金虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhenxiangkai at 2014-11-25 08:30:50
引物设计其实很简单,就是要你基因的两端,5-3端,我们只要把5端的20个左右就可以了,当然,需要的时候可以加些酶切位点,保护碱基之类的,很简单的。主要我做的是做普通的那种

没那么简单吧,怎么知道有没有引物互补或发夹结构等,特异性好不好什么的
7楼2014-11-25 20:32:13
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xlx906047684

金虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 意萧02 at 2014-11-25 09:59:43
5'端就是个定位定点作用,关键是3‘端的设计好吗?...

1 gaaaacccat tcgatcgatc attagtactt ccaactaaac tagcaagcta gtgagagatg
       61 gcagcttcaa ctgaagagat gacgaaggca ctaacagccg ccaccgtcct ggccatcggc
      121 acggccaatc ctcccaattg ctactaccaa gctgactttc ccgacttcta cttccgcgcc
      181 accaacagcg accacctcac ccacctcaag cacaaattca agcgcatttg tgagaagtca
      241 atgatcgaga agcgttacct tcaattgacg gaagacattc tcaaagaaaa cccgaatatc
      301 ggtgcgtacg aggcaccatc attggatgta agacacgaaa ttcaagtgaa aggagttgca
      361 cagcttggga aagaggccgc tctcaaggcc atgcaagagt ggggccaacc caaatctaag
      421 atcacacatc tcatcgtgtg ttgcatagcc ggggttgaca tgccaggcgc agattatcaa
      481 ctcactaagc ttcttgacct aaactcttct gttaagcgct tcatgtttta ccacctagga
      541 tgttacgctg gtggcaccgt ccttcgtctt gccaaggata tagccgagaa caacaaagga
      601 gctcgtgttc tcatagtttg ttcagagatg acgccaatct gcttccgtgg gccatctgaa
      661 acccatatag actccatggt agggcaagca atatttggtg atggtgctgc agctgtcata
      721 gttggagcga acccagacct aacagttgag aagcccattt tcgagttgat ttccacagcc
      781 caaactatca tacctgaatc tgatggtgcg attgagggcc atttgctaga agttggactc
      841 agtttccaac tctaccagaa tgtccccgca ctaatctcta atagcatagg aacatgcctt
      901 tcagaagctt tcacccctct aaacattagc aattggaact ccctcttctg gatcgcacat
      961 cctggtggcc ctgctatcct agaccatgtt gaggccaccg ttggtctcaa caaggagaaa
     1021 cttaaggcaa ccagacaagt gctgaacgac tatggaaaca tgtcaagtgc ttgtgtgttt
     1081 tttatcatgg atgagatgag gaagaagtca cttgaaaacg gccacgcaac gactggagaa
     1141 ggactgcagt ggggcgttct gtttggattc gggcctggta ttactgttga aactgtggtg
     1201 ctacgaagtg tgcccatcat ttaactcaaa atgattgaat cacgtacttc caattagtaa
     1261 tatatgttca tccttctgta tcggtagagt tgatctgatg tctttgtgtt ttctttatta
     1321 ttgagccctt ttgatcatgt accctgaata attgtgagtt tcctccacaa tgggaacgct
     1381 tgtatgatag cattttcaat ttaaagaata acattatatt cgatctcc
其中57bp到1224bp为编码区,导师给我设计了两对引物
第一对 F:atggcagcttcaactgaag  R:ttaaatgatgggcacacttc
第二对 F:gatggcagcttcaactgaag  R:atgatgggcacacttcgtag
第一对引物和文献上的一样,但扩增结果和文献上完全不一样,只是没加文献上的酶切位点和保护碱基,文献上得到的是1137bp,我得到的亮带是300bp左右 ,而且第二对引物和第一对得到的结果完全不一样,其实两对引物差别也不大,就第二对引物得前引物在5端加了一个g,后引物往编码区内移了4个bp,所以感觉好奇怪,老师说要重新设计引物,怎么设计啊,
9楼2014-11-25 20:51:14
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xlx906047684

金虫 (著名写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by utryer at 2014-11-25 20:38:31
ncbi上有一个primer-blast程序,运行一下就全明白了,再者,文献中的引物千万不可全信。

这么简单吗,能不能说的具体点啊,我之前学的化学,现在才开始做分子,好多还不太懂,谢谢帮忙啊
10楼2014-11-25 21:33:38
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