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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液PCR中没加片段和用水作对照都有条带，怎么解释？？？
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yan342221

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCR中没加片段和用水作对照都有条带，怎么解释？？？ 已有1人参与

做连接时有对照没加片段和没加连接酶，涂板摇菌后菌液PCR都有条带，用水作模板也有条带，条带位置还是应有的位置，怎么解释？？？是什么东西污染了吗，怎么解决？
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1楼 2014-10-18 15:28:27
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s_lich28

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-10-19 00:32:26
yan342221: 金币+5 2014-10-20 19:03:04
首先说没加连接酶，能想到的可能是楼主在载体的纯化中没割胶回收，导致没有被切割的载体一起混在最后的连接混合物中。所以如果不幸言中的话请楼主割胶回收酶处理过的载体。
然后是加水也能连上，当然上述没被切割的载体的污染也会导致这个问题，但更常见的原因是酶切过后的载体没经过去磷酸化（BAP或CIAP）处理，导致载体的自我连接（这种情况在单酶切下发生率很高！）。
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There is nothing either good or bad, thinking makes it so.
2楼2014-10-18 22:43:43
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yan342221

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by s_lich28 at 2014-10-18 22:43:43
首先说没加连接酶，能想到的可能是楼主在载体的纯化中没割胶回收，导致没有被切割的载体一起混在最后的连接混合物中。所以如果不幸言中的话请楼主割胶回收酶处理过的载体。
然后是加水也能连上，当然上述没被切割的 ...

那请问水的条带跟目标条带为什么一致？
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3楼2014-10-20 19:02:49
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s_lich28

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yan342221 at 2014-10-20 20:02:49
那请问水的条带跟目标条带为什么一致？...

因为不知道楼主的实验体系，所以只能做猜测。如果楼主加水连接载体然后做菌落PCR出现目标条带大小一致的条带，那说明菌体里含有的不是空的载体，能作出的猜测就是载体被原来未切割的质粒污染了。
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There is nothing either good or bad, thinking makes it so.
4楼2014-10-20 23:24:19
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