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[交流]
麻烦问一下实验室做表达经常不成功是怎么回事 已有8人参与
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实验室做的都是基因克隆，转化，然后表达，实验室比较新，也不太有钱，大家所有的步骤都是一样的，用的都是pet-28a（+）质粒，剪切酶都是BamHⅠ、HindⅢ，都是导入到bl21（d3）中，表达都是用iptg诱导，但是据我所知，往届的学姐学长们，表达做出来的都很少，大部分都是做到转化成功，然后做不出来，换题了。 现在我做自己的题也是，到转化怎么也不成功，我们这一届5个人，就一个人成功了，从转化开始各种条件我感觉都做过了，就是看不到条带 这是不是通病啊，问题会不会出在构建体系和转化体系部分。好像我们老师并没有换体系的意思啊，咋办 |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-10-16 11:15:24
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-10-16 11:15:24
| 这个原因太多了。首先，要转化进入细胞之前，肯定是构建含正确目标序列的表达载体。怎么验证你的表达载体构建正确了？酶切，测序，PCR扩增等方法。这些都没有问题吗？如果一切OK，那么就考虑是否是要转化的细胞没有处理好感受态，根本就没转进去呢？转化后的培养，相比也设置了，阴性对照（空的转化细胞），阳性对照（含空质粒的转化细胞），以及含有你表达序列的转化细胞。三种同时培养，都有细胞筛选出来吗？后期验证的时候，当然也是要阳性对照和目的条带一起PCR验证了。涉及到的操作步骤较多，试剂也多，建议还是要仔细审查每一步骤，确保每一步操作都正确吧。 |
3楼2014-10-14 11:23:05
2楼2014-10-14 10:34:39
lxj341401
至尊木虫 (著名写手)
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- 应助: 388 (硕士)
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4楼2014-10-14 11:34:17
5楼2014-10-15 21:20:19
