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云海寻烟

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于病毒滴度 已有1人参与

各位虫友，我做了一次病毒滴度，但是很莫名其妙的细胞就死了，请各位虫友帮忙分析一下。
具体过程：
   1、用10%FBS的DMEM培养基培养Vero细胞
   2、做病毒梯度：用无血清无双抗的DMEM培养基稀释病毒液，分别得到-2、-3、-4三个梯度；
   3、待细胞长至80%左右时，将上述病毒加至12孔板中，100微升每孔，另每孔加1ml无血清无双抗培养基；
   4、2小时20分钟后换液，（因有事耽误了，没能在两小时之内换液，且换液前观察已发现部分细胞呈沙状）过夜培养
   5、观察发现，细胞大部分呈沙状。
附图：

关于病毒滴度
无标题004.jpg


关于病毒滴度-1
无标题002.jpg


关于病毒滴度-2
无标题003.jpg
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1楼 2014-09-04 15:37:21
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云海寻烟

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-09-09 15:37:31
你应该做一下支原体检查，排除培养基污染的情况，有很多试剂盒可以做，你搜一下药典方法。
平行是为了证明细胞本身没有问题，如果没有做平行，你不能排除细胞本身的问题。
病毒本身会有毒力变化，稀释度过少，毒 ...

恩  好 谢谢你
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5楼2014-09-10 13:32:54
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
云海寻烟(星海慧儿代发): 金币+1, 多谢回帖交流 2014-09-09 21:38:26
1.添加的培养基支原体 检查情况如何？
2.病毒稀释手法有没有做平行？
3.病毒有没有吹打？
4.换带血清的稀释液稀释病毒试试。
5.接毒前细胞情况如何？
6.接毒后有没有做无毒细胞平行？平行情况如何？
7.稀释度再多几个梯度试试。
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2楼2014-09-04 16:47:09
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云海寻烟

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-09-04 16:47:09
1.添加的培养基支原体 检查情况如何？
2.病毒稀释手法有没有做平行？
3.病毒有没有吹打？
4.换带血清的稀释液稀释病毒试试。
5.接毒前细胞情况如何？
6.接毒后有没有做无毒细胞平行？平行情况如何？
7.稀释度 ...

1、培养基支原体情况没有检查，而且从来没有做过检查呀，请问一下这个该怎么检查呀？
2、没有做平行，以前都是用24孔板，而且是-4、-5、-6这三个梯度，现在用12孔板，-2、-3、-4这三个梯度，病毒量比较大就没做平行；
3、病毒吹打了，每个都用1ml枪头吹打50次；
4、以前做病毒稀释一直是用无血清的培养基稀释病毒的，从来没有出现过这种情况啊；
5、接毒前细胞状况良好；
6、有无毒细胞平行，用的是无血清无双抗的培养基，跟其他有病毒的细胞一块换的液，均换为10%血清的DMEM;
7、这个可以考虑一下，但是为什么会跟梯度有关呢？
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3楼2014-09-05 09:01:20
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wolfman840

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 云海寻烟 at 2014-09-05 09:01:20
1、培养基支原体情况没有检查，而且从来没有做过检查呀，请问一下这个该怎么检查呀？
2、没有做平行，以前都是用24孔板，而且是-4、-5、-6这三个梯度，现在用12孔板，-2、-3、-4这三个梯度，病毒量比较大就没做平 ...

你应该做一下支原体检查，排除培养基污染的情况，有很多试剂盒可以做，你搜一下药典方法。
平行是为了证明细胞本身没有问题，如果没有做平行，你不能排除细胞本身的问题。
病毒本身会有毒力变化，稀释度过少，毒力也就意味着高了，感染同体积细胞的病毒多了，细胞不耐受，就挂了。所以稀释度也有关系。
总之，你需要考虑三个方面，培养基、细胞本身、病毒。
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4楼2014-09-09 15:37:31
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