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[求助]
求助 虫友们 帮解决【定量PCR】 问题。
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本人最近在做定量PCR过程中，出现了如下图中所出现的问题一些，望各位虫友帮忙解决一下，谢谢！。总结下来有： 1） 本人使用的生工编号：SK2957A（SGExcel UltraSYBR Mixture）试剂盒，运用的是一步定量PCR方法，每次跑提取质粒的各稀释倍数做标准曲线，很不错，扩增效率能保证在100%左右，R2基本上也能控制在0.95到1之间。 反应体系是：SYBR MIX+Primer1+Primer2+DNA Template+ ddH2O=12.5+0.5+0.5+2+9.5=25ul 反应条件是：见附图。 2）但是，每次做阴性对照（即以ddH2O为模板）时，总有扩增出现，Ct值出现在33-37之间。 3）样品DNA稀释10倍上样，扩增Ct重复性很差，并不像标线一样，重复性很好，而且溶解曲线温度和标线温度很不同。标线样品的溶解温度基本都是86度，而样品溶解温度都是78-84之间，是不是就说明没有扩增出目的片段啊？ 下图附上昨天晚上刚做的一次实验结果图谱。 图中蓝色线是未知样品，绿色是标样，红色是阴性对照。  标线-扩增曲线.png  反应条件.png  溶解曲线-2.png  扩增曲线-1.png  溶解曲线-1.png |
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