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新手蛋白分离纯化过程中，询问过程中一些试剂配制及细节问题，望高手，提供帮忙 已有3人参与
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我是新手，第一次做蛋白提取纯化的课题。我要的蛋白是59KD，首次实验完全按照已有文献的步骤进行提取，在4度下进行实验。但是到最后离子交换层析时，却无法跑出漂亮的图谱，而是上样后，曲线无法走出漂亮的基线，而是一直小幅度抛物线的走线，无法判断走稳的基线也无法得到蛋白的峰。因初步实验，询问过其他会层析操作的人，层析的装柱上样等操作并无问题。所以个人怀疑是不是自己操作过程中试剂配制错误或者细节操作出了问题，导致蛋白变性。个人对其中存在的疑问是： ①因实验是在4度下进行，因此饱和硫酸铵应该是在4度下用氨水调pH到7.0，这一操作没有错误吧？ ②层析时所用的平衡缓冲液是0.025M的柠檬酸-柠檬酸钠的缓冲液pH6.0，我按照标准缓冲液的配制的母液0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，按提供的配比稀释后配制，但是用pH计在4度下测定的时候，所得到缓冲液的pH值并不是6.0，而是5.7；有资料说用共轭的酸碱调节pH,但是我用柠檬酸钠去调pH到6.0时，加入的柠檬酸钠量极大。同时怀疑破坏了离子强度。因此，请问，这一缓冲液该如何配制？若配制没有问题，那么是否可以在根据配比稀释到0.025M后，4度下用氢氧化钠溶液调节pH至所需值呢？ ③蛋白分离提取的过程中，第一步提取离心得到的沉淀后，要用柠檬酸盐溶液洗涤，但是利用文献所提供的洗涤体积较小，根本无法完全从离心管中将大量的沉淀完全打散混匀，并且过程中出现了气泡。此过程中怀疑蛋白发生了变性，请问有何种更为好用的方法可以讲小量的体积将沉淀完全混匀呢？我试过磁力搅拌和混旋仪均无法将沉淀完全均匀混合。 我知道上述都是小问题，还希望各位高手能够提供。 |
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