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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 新手蛋白分离纯化过程中，询问过程中一些试剂配制及细节问题，望高手，提供帮忙
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celine_21

新虫 (初入文坛)

[求助] 新手蛋白分离纯化过程中，询问过程中一些试剂配制及细节问题，望高手，提供帮忙 已有3人参与

我是新手，第一次做蛋白提取纯化的课题。我要的蛋白是59KD，首次实验完全按照已有文献的步骤进行提取，在4度下进行实验。但是到最后离子交换层析时，却无法跑出漂亮的图谱，而是上样后，曲线无法走出漂亮的基线，而是一直小幅度抛物线的走线，无法判断走稳的基线也无法得到蛋白的峰。因初步实验，询问过其他会层析操作的人，层析的装柱上样等操作并无问题。所以个人怀疑是不是自己操作过程中试剂配制错误或者细节操作出了问题，导致蛋白变性。个人对其中存在的疑问是：
①因实验是在4度下进行，因此饱和硫酸铵应该是在4度下用氨水调pH到7.0，这一操作没有错误吧？
②层析时所用的平衡缓冲液是0.025M的柠檬酸-柠檬酸钠的缓冲液pH6.0，我按照标准缓冲液的配制的母液0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，按提供的配比稀释后配制，但是用pH计在4度下测定的时候，所得到缓冲液的pH值并不是6.0，而是5.7；有资料说用共轭的酸碱调节pH,但是我用柠檬酸钠去调pH到6.0时，加入的柠檬酸钠量极大。同时怀疑破坏了离子强度。因此，请问，这一缓冲液该如何配制？若配制没有问题，那么是否可以在根据配比稀释到0.025M后，4度下用氢氧化钠溶液调节pH至所需值呢？
③蛋白分离提取的过程中，第一步提取离心得到的沉淀后，要用柠檬酸盐溶液洗涤，但是利用文献所提供的洗涤体积较小，根本无法完全从离心管中将大量的沉淀完全打散混匀，并且过程中出现了气泡。此过程中怀疑蛋白发生了变性，请问有何种更为好用的方法可以讲小量的体积将沉淀完全混匀呢？我试过磁力搅拌和混旋仪均无法将沉淀完全均匀混合。

我知道上述都是小问题，还希望各位高手能够提供。
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1楼 2014-08-10 19:01:38
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andyzheng0504

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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youlinglyw: 金币+3 2014-08-11 23:56:06
youlinglyw: 金币+3 2014-08-11 23:56:32
室温下调ph再降温，试剂尽可能用好的或者更高纯度

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2楼2014-08-10 20:15:33
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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youlinglyw: 金币+3 2014-08-11 23:56:16
youlinglyw: 金币+3 2014-08-11 23:56:31
1.你的操作没问题。
2.你的pH指的是室温下的pH，需要查一下所需溶液在4℃下的pH。并且柠酸缓冲液对pH的缓冲能力挺好的，用NaOH调会造成失去缓冲对的情况。建议配好后不要调。
3.如果你采用硫酸铵沉淀后，加入柠檬酸有气泡是正常的。洗涤体积不用纠结，至少应该能重悬起来，pH在可以耐受的范围内就好了。
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3楼2014-08-11 10:39:46
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flyingsky305

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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youlinglyw: 金币+3 2014-08-11 23:56:27
做完硫酸胺要至少透析2次，每次6小时以上，再做下一步。生化实验没教吗？
离子交换需要小量上柱，根据峰图，跑胶加上活性测定确定目的条带，再调整盐浓度，再调整。必要时调整缓冲液。没问题了，再大量上样离子交换柱。你用酸性缓冲液，应该是用阳离子柱，蛋白是偏碱性吧？

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4楼2014-08-11 20:51:39
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flyingsky305

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果你对我最后一个问题的回答是肯定的，那么pH差那一点应该没问题的。

看你用柠檬酸盐做离子柱的缓冲液，可能你看文献这个蛋白可以溶解在它里面吧？试试不要吸打。放在脱色小摇床，4度慢速混匀，完全溶解后就做透析，再做下一步。

联系生化理论书和实验书再看看

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5楼2014-08-11 21:02:12
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