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kkcs2006

木虫 (知名作家)
看不懂哈 我是来领金币的
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上善若水大智若愚
31楼2014-08-05 13:28:12
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Phoebe.Lee(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-05 13:59:17
从你引物的设计看，GC%比较高，退火温度高一些试试。
保护碱基我们一般就加CTAG
引物的特异性怎么样，设计时没非特异性扩增吧
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32楼2014-08-05 13:34:08
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。
引用回帖:
27楼: Originally posted by jonew at 2014-08-05 09:09:25
目的条带是多大呢？我想你该提高退火温度了，至少五度吧！！！

目的条带1600
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岁月静好
33楼2014-08-05 15:02:01
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。
引用回帖:
26楼: Originally posted by xiaohongma at 2014-08-05 09:07:41
你合成订单上的TM值是没有参考价值的，因为你后面是加了酶接头的，除去酶接头之后的Tm值才真正有参考价值

哦 不加酶切位点的引物tm值有75度
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岁月静好
34楼2014-08-05 15:04:20
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。
引用回帖:
24楼: Originally posted by 悠悠飘杨 at 2014-08-05 08:49:07
你可以加点5%的DMSO试试，可以解除引物二聚体，提高特异性，我看图上的结果，好像引物二聚体挺多的。

好的 试试看
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岁月静好
35楼2014-08-05 15:04:55
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xiaohongma

新虫 (小有名气)
引用回帖:
34楼: Originally posted by Phoebe.Lee at 2014-08-05 15:04:20
哦 不加酶切位点的引物tm值有75度...

怎么可能更高呢

[ 发自小木虫客户端 ]
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36楼2014-08-05 15:05:59
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。
引用回帖:
11楼: Originally posted by xzy0425 at 2014-08-04 20:48:41
从图上看，非目的条带很多，且高度重复，你可以考虑引物的特异性方面，看看要不要换个引物；其次，由于目的条带为1600bp，适当将热变性及退火时间增加到40s、45s或1min；再考虑适当提高退火温度，摸索一下PCR参数条 ...

恩 谢谢
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岁月静好
37楼2014-08-05 15:06:13
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。
引用回帖:
14楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-08-04 21:19:30
不知道你marker条带，但看得出 非特异性条带很多。另外不知道你用什么做的模板？

Takara 2000的marker 用有目的基因的质粒做模板
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岁月静好
38楼2014-08-05 15:07:11
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。
引用回帖:
36楼: Originally posted by xiaohongma at 2014-08-05 15:05:59
怎么可能更高呢
...

是用TM值计算的软件算的，算出来的加酶切位点后tm值有79度
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岁月静好
39楼2014-08-05 15:14:27
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。
引用回帖:
16楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-08-04 23:02:21
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致（作者：凌波丽)

2013年9月24日

    PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：
I.引物与靶序 ...

太详细了  万分感谢
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岁月静好
40楼2014-08-05 15:15:16
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