24小时热门版块排行榜    

查看: 3908  |  回复: 85
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。

[求助] PCR求指点 已有35人参与

自己设计的引物扩增基因编码区序列
上游引物:  CCGGAATTC ATGGCCGCGCAGCTGCTGGAGG                 
下游引物:CGCGTCGA CTCAGCTGAGCACCTCTTCCTGGGGC      
加了酶切位点和保护碱基   
引物合成订单给出的tm值分别为65.9和67.8(Tm (50mM Na+) )

做了温度梯度56-64
反应条件:35个循环  Takara  Taq酶   目的片段1600左右
                  94       5min
                  94        30s
                  56-64   30s
                  72        2min
                  72        10min
PCR跑胶结果如图,求大神指点

PCR求指点
jiaotu.jpg
回复此楼
岁月静好
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
Phoebe.Lee(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-05 13:58:41
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致(作者:凌波丽)

2013年9月24日

    PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带,其原因与对策如下:
I.引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体、或者GC比邻远离50%。对策:重新设计引物。
II.Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数 过多有关。
III.靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:
     1.整个基因组或大片段的交叉污染,导致非特异性带出现。
这种非特异性带出现可用以下方法解决:
(1)在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
(2)除了酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。
(3)所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。
(4)重新提取模板DNA。
    2.空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。
对策:实验前对实验室充分通风,试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间,还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染,最基本的解决办法:重新提取模板DNA。
IV.考虑使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶,也可以用石蜡隔离模式。
V.调整变性和退火温度时间。
VI.更换所有缓冲溶液,使用全部新配的缓冲溶液。这点可能太基本了,很不被重视。
VII.适当调高复性温度。没有重新设计引物,不要大范围地变动反应体系的复性温度,要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增,则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度;如果出现任何扩增带,则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。
VIII.Taq酶的专一性扩增不够。往往一些来源的DNA聚合酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策:改用专一性更强的DNA聚合酶,或者使用两种不同的DNA聚合酶,减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时,酶量不要太大,以免出现特异性扩增。
    酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。
IX.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时,非特异性扩增较多,这时,最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环,退火温度降低1-2度,直至到达正常的Tm附近的退火温度。
X.适当减低的dNTP的浓度,可以分梯度进行。
一般的调整顺序(不是绝对的):若PCR反应后无任何产物,可先调整Mg2+ 浓度,Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L,不低于1.0mmol/L,调整时从低往高分梯度加,每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。同时全部重新配所有的缓冲溶液。 然后调整引物浓度,在调整引物与模板的结合温度,调整变性和退火温度时间。接着或者与引物调整同时,把酶换成其他类型的DNA聚合酶(高保真酶或者热启动酶)。再往后,检测和重新提取DNA模板(包括用质谱或者电泳检测DNA是否变短,清除酚和SDS,检测模板浓度,必要时要对DNA模板测序)。再往后和使用梯度降低dNTP。最后这些都做了仍未奏效,那么就要重新设计引物了。一般是最先调整Mg2+ 浓度,最后重新设计引物,其他顺序可变。Mg2+ 浓度与dNTP的浓度一般同方向偶联调节。
XI.适当减少退货时间和提高退火温度。
XII.在反应体系中加入:1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率。
过去,我也回答过PCR非特异性扩增的问题,但是这次回答我在2013年8月14日重新编辑核对的。
XIII.使用巢式PCR。
更正:2楼和3楼:调整镁离子浓度时,可以与dNTP正相关的梯度调整,两者同方向分梯度调节,一般不要反方向调节;但是可以单独镁离子浓度,而dNTP浓度不动;有时候dNTP浓度调整不大时也可以不动镁离子浓度,因为镁离子浓度太高了,可能会增加非特异性扩增,或者有时候就是可以不动dNTP浓度而只调节镁离子浓度也能够增加PCR的专一性。
     我参考了yujitianqing的帖子,http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6198669
过去我没有注意到,而后我去查阅了文献,有的文献与yujitianqing的帖子的内容基本上一致,也有些文献与yujitianqing的帖子的内容并不一致。

参考一下吧。
16楼2014-08-04 23:02:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 86 个回答

Phoebe.Lee(金币+1): 谢谢参与
祝福

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-08-04 17:07:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chyzm

铁杆木虫 (职业作家)

感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2014-08-04 19:41:04
我不太懂,不是说回复就有金币么?
5楼2014-08-04 17:44:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

aabuzhangjun

新虫 (知名作家)

祝福,祈福,愿楼主今后一切顺利,愿自己及女朋友工作顺利,祈福!
6楼2014-08-04 17:54:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
信息提示
请填处理意见