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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。

应助: 1 (幼儿园)
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专业: 细胞增殖、生长与分化

[求助] PCR求指点已有35人参与

自己设计的引物扩增基因编码区序列
上游引物:  CCGGAATTC ATGGCCGCGCAGCTGCTGGAGG
下游引物：CGCGTCGA CTCAGCTGAGCACCTCTTCCTGGGGC
加了酶切位点和保护碱基
引物合成订单给出的tm值分别为65.9和67.8（Tm (50mM Na+) )

做了温度梯度56-64
反应条件：35个循环  Takara  Taq酶目的片段1600左右
               94    5min
               94       30s
               56-64 30s
               72       2min
               72       10min
PCR跑胶结果如图，求大神指点

jiaotu.jpg

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岁月静好

1楼 2014-08-04 17:03:01

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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Phoebe.Lee(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-05 13:58:41

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致（作者：凌波丽)

2013年9月24日

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，其原因与对策如下：
I.引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体、或者GC比邻远离50%。对策：重新设计引物。
II.Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
III.靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：
1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。
这种非特异性带出现可用以下方法解决：
（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
（4）重新提取模板DNA。
2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。
对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。
IV.考虑使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。
V.调整变性和退火温度时间。
VI.更换所有缓冲溶液，使用全部新配的缓冲溶液。这点可能太基本了，很不被重视。
VII.适当调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。
VIII.Taq酶的专一性扩增不够。往往一些来源的DNA聚合酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策：改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。
酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。
IX.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
X.适当减低的dNTP的浓度，可以分梯度进行。
一般的调整顺序（不是绝对的）：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。同时全部重新配所有的缓冲溶液。然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度，调整变性和退火温度时间。接着或者与引物调整同时，把酶换成其他类型的DNA聚合酶（高保真酶或者热启动酶）。再往后，检测和重新提取DNA模板（包括用质谱或者电泳检测DNA是否变短，清除酚和SDS，检测模板浓度，必要时要对DNA模板测序）。再往后和使用梯度降低dNTP。最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。一般是最先调整Mg2+ 浓度，最后重新设计引物，其他顺序可变。Mg2+ 浓度与dNTP的浓度一般同方向偶联调节。
XI.适当减少退货时间和提高退火温度。
XII.在反应体系中加入：1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率。
过去，我也回答过PCR非特异性扩增的问题，但是这次回答我在2013年8月14日重新编辑核对的。
XIII.使用巢式PCR。
更正:2楼和3楼：调整镁离子浓度时，可以与dNTP正相关的梯度调整，两者同方向分梯度调节，一般不要反方向调节；但是可以单独镁离子浓度，而dNTP浓度不动；有时候dNTP浓度调整不大时也可以不动镁离子浓度，因为镁离子浓度太高了，可能会增加非特异性扩增，或者有时候就是可以不动dNTP浓度而只调节镁离子浓度也能够增加PCR的专一性。
我参考了yujitianqing的帖子，http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6198669
过去我没有注意到，而后我去查阅了文献，有的文献与yujitianqing的帖子的内容基本上一致，也有些文献与yujitianqing的帖子的内容并不一致。

参考一下吧。