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崔永霞铁虫 (小有名气)
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X33菌落PCR 已有4人参与
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| 请教各位高手，我最近在做酵母X33电击转化，转化后的X33涂到带有ZEOCIN抗生素的YPD平板上时，三天后长出单菌落，我用宝生物买的lysis buffer 破壁X33释放基因组DNA，然后离心取上清液做菌落PCR, 都没有条带，总共有47个单菌落（我做了六次电击转化，涂了30个板总计），难道这47个单菌落都是假阳性吗？有没有其他可能呢，我还把单菌落挑到5ml生物YPD+Zeocin液体培养基中培养，然后把过夜培养也生长的送去测序都没测出结果，求各位高手指点。 |
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2楼2014-07-31 09:55:53
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5楼2014-07-31 15:00:40
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1.宝生物的lysis buffer 裂解酵母应该没有问题，只是不要挑菌太多。你可以把47个菌用zeocin 梯度筛选一下，既可以进一步鉴定是否为阳性转化子也可能得到高拷贝，同时也会筛掉一大部分，这样PCR鉴定工作量就小多了。 2.你送去测序送的是菌液？是否和测序公司沟通过毕赤酵母转化子确实可以送菌液？如果他们按照一般大肠杆菌处理，就很有可能测不出来。不知，你说的“送出去测序都没结果”是什么意思？是测序反应失败还是测出来没有你的目的基因？ 3.你是转了6次才得到47个转化子的吗？如果是这样，转化效率确实较低，不知你用的电转仪是国产的还是进口的，哪家公司？国产的要差很多。其实酵母用1500v，200Ω，25uF电转化是很好的，要优化的就是你的线性化质粒的纯度和浓度，一般80ul感受态加入10-15ul（约10ug）线性化质粒。 4.制作感受态时，记得全程冰浴，离心用低转速,1500g足以，电转后要快速加入冰预冷的1M山梨醇。 |
6楼2014-07-31 15:10:51
luwei13566
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9楼2014-08-01 09:05:48
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