| 查看: 1279 | 回复: 13 | ||
崔永霞铁虫 (小有名气)
|
[求助]
X33菌落PCR 已有4人参与
|
| 请教各位高手，我最近在做酵母X33电击转化，转化后的X33涂到带有ZEOCIN抗生素的YPD平板上时，三天后长出单菌落，我用宝生物买的lysis buffer 破壁X33释放基因组DNA，然后离心取上清液做菌落PCR, 都没有条带，总共有47个单菌落（我做了六次电击转化，涂了30个板总计），难道这47个单菌落都是假阳性吗？有没有其他可能呢，我还把单菌落挑到5ml生物YPD+Zeocin液体培养基中培养，然后把过夜培养也生长的送去测序都没测出结果，求各位高手指点。 |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有244人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有8人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
songzuowei
木虫 (著名写手)
- 应助: 88 (初中生)
- 金币: 2666.2
- 散金: 18
- 红花: 7
- 帖子: 2058
- 在线: 98.5小时
- 虫号: 2469387
- 注册: 2013-05-17
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
2楼2014-07-31 09:55:53
崔永霞
铁虫 (小有名气)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 2349.7
- 散金: 82
- 红花: 4
- 帖子: 275
- 在线: 71.9小时
- 虫号: 1967965
- 注册: 2012-09-01
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
3楼2014-07-31 14:00:23
songzuowei
木虫 (著名写手)
- 应助: 88 (初中生)
- 金币: 2666.2
- 散金: 18
- 红花: 7
- 帖子: 2058
- 在线: 98.5小时
- 虫号: 2469387
- 注册: 2013-05-17
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
4楼2014-07-31 14:58:30
songzuowei
木虫 (著名写手)
- 应助: 88 (初中生)
- 金币: 2666.2
- 散金: 18
- 红花: 7
- 帖子: 2058
- 在线: 98.5小时
- 虫号: 2469387
- 注册: 2013-05-17
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
5楼2014-07-31 15:00:40
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
崔永霞: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-08-01 08:58:28
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-01 10:26:54
感谢参与，应助指数 +1
崔永霞: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-08-01 08:58:28
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-01 10:26:54
|
1.宝生物的lysis buffer 裂解酵母应该没有问题，只是不要挑菌太多。你可以把47个菌用zeocin 梯度筛选一下，既可以进一步鉴定是否为阳性转化子也可能得到高拷贝，同时也会筛掉一大部分，这样PCR鉴定工作量就小多了。 2.你送去测序送的是菌液？是否和测序公司沟通过毕赤酵母转化子确实可以送菌液？如果他们按照一般大肠杆菌处理，就很有可能测不出来。不知，你说的“送出去测序都没结果”是什么意思？是测序反应失败还是测出来没有你的目的基因？ 3.你是转了6次才得到47个转化子的吗？如果是这样，转化效率确实较低，不知你用的电转仪是国产的还是进口的，哪家公司？国产的要差很多。其实酵母用1500v，200Ω，25uF电转化是很好的，要优化的就是你的线性化质粒的纯度和浓度，一般80ul感受态加入10-15ul（约10ug）线性化质粒。 4.制作感受态时，记得全程冰浴，离心用低转速,1500g足以，电转后要快速加入冰预冷的1M山梨醇。 |
6楼2014-07-31 15:10:51
luwei13566
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 184 (高中生)
- 金币: 4351.4
- 散金: 97
- 红花: 35
- 帖子: 641
- 在线: 261.1小时
- 虫号: 2380655
- 注册: 2013-03-27
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
7楼2014-07-31 17:10:17
8楼2014-07-31 22:48:45
崔永霞
铁虫 (小有名气)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 2349.7
- 散金: 82
- 红花: 4
- 帖子: 275
- 在线: 71.9小时
- 虫号: 1967965
- 注册: 2012-09-01
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
9楼2014-08-01 09:05:48
崔永霞
铁虫 (小有名气)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 2349.7
- 散金: 82
- 红花: 4
- 帖子: 275
- 在线: 71.9小时
- 虫号: 1967965
- 注册: 2012-09-01
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
10楼2014-08-01 09:06:21
