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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » X33菌落PCR
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崔永霞

铁虫 (小有名气)

[求助] X33菌落PCR 已有4人参与

请教各位高手，我最近在做酵母X33电击转化，转化后的X33涂到带有ZEOCIN抗生素的YPD平板上时，三天后长出单菌落，我用宝生物买的lysis buffer 破壁X33释放基因组DNA，然后离心取上清液做菌落PCR, 都没有条带，总共有47个单菌落（我做了六次电击转化，涂了30个板总计），难道这47个单菌落都是假阳性吗？有没有其他可能呢，我还把单菌落挑到5ml生物YPD+Zeocin液体培养基中培养，然后把过夜培养也生长的送去测序都没测出结果，求各位高手指点。
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
1楼 2014-07-31 09:40:48
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-31 13:59:54
崔永霞: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-31 14:00:52
酵母X33的壁比较厚，鉴定阳性不建议用你采用的方法，建议采用提取酵母基因组然后再鉴定阳性的方法，可能费时，但很可靠。另外你的电转效率可能较低，应摸索一下电转条件
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2楼2014-07-31 09:55:53
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-31 09:55:53
酵母X33的壁比较厚，鉴定阳性不建议用你采用的方法，建议采用提取酵母基因组然后再鉴定阳性的方法，可能费时，但很可靠。另外你的电转效率可能较低，应摸索一下电转条件

可是我送出去测序都没结果啊
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
3楼2014-07-31 14:00:23
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 崔永霞 at 2014-07-31 14:00:23
可是我送出去测序都没结果啊...

所以我猜测可能你的电转条件不合适 你再摸索一下电转条件，转化效率低的话，你可能随机挑了几个菌去测序，这几个菌都没转进去也是有可能的，你重新电转，通过抽酵母基因组方式阳性鉴定后，若鉴定出阳性就没问题了
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4楼2014-07-31 14:58:30
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
崔永霞: 金币+1, ★有帮助, 谢谢 2014-08-01 09:06:09
引用回帖:
3楼: Originally posted by 崔永霞 at 2014-07-31 14:00:23
可是我送出去测序都没结果啊...

还有你把单菌落送去测序，送了几个？没有结果是什么意思？至少能得到空载啊什么的结果啊 一点信号也没有的话就说明没转进去啊
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5楼2014-07-31 15:00:40
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shyh1983

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
崔永霞: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-08-01 08:58:28
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-08-01 10:26:54
1.宝生物的lysis buffer 裂解酵母应该没有问题，只是不要挑菌太多。你可以把47个菌用zeocin 梯度筛选一下，既可以进一步鉴定是否为阳性转化子也可能得到高拷贝，同时也会筛掉一大部分，这样PCR鉴定工作量就小多了。
2.你送去测序送的是菌液？是否和测序公司沟通过毕赤酵母转化子确实可以送菌液？如果他们按照一般大肠杆菌处理，就很有可能测不出来。不知，你说的“送出去测序都没结果”是什么意思？是测序反应失败还是测出来没有你的目的基因？
3.你是转了6次才得到47个转化子的吗？如果是这样，转化效率确实较低，不知你用的电转仪是国产的还是进口的，哪家公司？国产的要差很多。其实酵母用1500v，200Ω，25uF电转化是很好的，要优化的就是你的线性化质粒的纯度和浓度，一般80ul感受态加入10-15ul（约10ug）线性化质粒。
4.制作感受态时，记得全程冰浴，离心用低转速,1500g足以，电转后要快速加入冰预冷的1M山梨醇。
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6楼2014-07-31 15:10:51
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
崔永霞: 金币+1, ★有帮助, 嗯，我试试，谢谢！ 2014-08-01 08:57:23
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-01 10:27:06
1 用的是最普通的taq酶做的验证？换些好一点的酶做对模板的灵敏度会好一些。
2 如果实在验证不出来可以直接诱导一批看看蛋白，zeocin筛选的假阳性概率很低的，顶多会有拷贝数的差异。先筛个抗性梯度也可以

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大家相互帮助哈
7楼2014-07-31 17:10:17
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圆yy

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
崔永霞: 金币+1, ★★★很有帮助, 嗯，谢谢！ 2014-08-01 08:56:40
基因组提取了先做个pcr看看，能不能有目的基因在里面？？？如果没有或者有，在决定吧。分子实验熬得就是时间和经历
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8楼2014-07-31 22:48:45
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by shyh1983 at 2014-07-31 15:10:51
1.宝生物的lysis buffer 裂解酵母应该没有问题，只是不要挑菌太多。你可以把47个菌用zeocin 梯度筛选一下，既可以进一步鉴定是否为阳性转化子也可能得到高拷贝，同时也会筛掉一大部分，这样PCR鉴定工作量就小多了。 ...

首先，非常感谢你的回复。有几个问题还想请教一下：1：47个菌用zeocin 梯度筛选是怎么个做法？ 2：我送的是菌液，测序结果单里面说的是测序反应失败，而且我也在测序单上备注了这是毕赤酵母X33菌液。3：我是转了六次选的1-4天长的但菌落，之后的菌落我没要。我用的是2kv，10ms。，电转移是国产的应该。至于你说的200Ω，25uF，电钻仪上就没这一项设置啊。4：离心是我用的5000rpm，难道是这个影响了电转效率吗？
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
9楼2014-08-01 09:05:48
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-31 15:00:40
还有你把单菌落送去测序，送了几个？没有结果是什么意思？至少能得到空载啊什么的结果啊 一点信号也没有的话就说明没转进去啊...

就说是测序失败
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10楼2014-08-01 09:06:21
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