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syp719

木虫 (正式写手)

[求助] SSR-PCR 杂带很多 求解决方案 已有2人参与

此图为SSR-PCR产物非变性PAGE电泳图谱，marker为20bp,第四条带为200bp,二倍体植物为什么这么多带，退火温度左边1-8为63.4度，右边8个为61.9度，上下游引物Tm值分别为59.8℃，59.6℃，是模板纯度不够还是PCR程序不适合还是反应体系不合适呢？求各位老师同学提供宝贵意见建议！谢谢！！！！
【备注：10ul反应体系PCRmix5-6ul,premierF/R各0.5ul,模板1ul(约40ng），ddH20补齐。
反应程序：94℃ 4min,94℃ 50S,63.4℃ 50S,72℃ 30S,30cycle,72℃ 7min,
电泳上样2ul,电泳40min,硝酸银染色，氢氧化钠甲醛溶液显色】

SSR-PCR 杂带很多  求解决方案
DSC04720.JPG
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好好品味生活！
1楼 2014-07-21 20:57:56
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867575969

至尊木虫 (著名写手)

One Piece
★ ★ ★ ★
syp719(kx444555代发): 金币+4, 鼓励交流 2014-07-22 08:34:19
杂带一般是非特异性扩增引起的，看lz的带跑的挺好的，也没有拖尾现象，只是带比较多。一般做ssr-pcr不就是比较基因组差异性吗，如果lz觉得带多进行分析时较麻烦，那估计得换个引物，提高特异性！
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有些东西因为得不到而变得美好，有些东西因为拥有而变得弥足珍贵！
2楼2014-07-22 07:59:36
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syp719

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 867575969 at 2014-07-22 07:59:36
杂带一般是非特异性扩增引起的，看lz的带跑的挺好的，也没有拖尾现象，只是带比较多。一般做ssr-pcr不就是比较基因组差异性吗，如果lz觉得带多进行分析时较麻烦，那估计得换个引物，提高特异性！

哦，有人说对于二倍体生物而言，SSR一般1-2条带，我这为什么都是3条以上，分不清主带。染色浅的带要统计吗
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好好品味生活！
3楼2014-07-22 09:09:50
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syp719

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 867575969 at 2014-07-22 07:59:36
杂带一般是非特异性扩增引起的，看lz的带跑的挺好的，也没有拖尾现象，只是带比较多。一般做ssr-pcr不就是比较基因组差异性吗，如果lz觉得带多进行分析时较麻烦，那估计得换个引物，提高特异性！

目的带应该是200bp,可是200-300bp之间好多样品3条带，300以上的也有几条染色清楚的要忽略不计吗
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好好品味生活！
4楼2014-07-22 09:16:47
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jbhu220

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
syp719: 金币+6, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-07-24 08:43:13
一般来说SSR产物有1-2条带，呈共显性，最好是single-locus变异。你这个引物可能设计不好，没有出现变异，而且非特异扩增很多，我估计有变异也是呈显性的
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5楼2014-07-23 15:26:21
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幺哥撸啊撸

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
syp719: 金币+5, ★有帮助, 谢谢 2014-07-24 08:42:46
我觉得只看最深的主带就行 上方的浅色带不用管 浅色带与主色带连锁 不用担心
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6楼2014-07-23 17:25:09
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
杂带一般都是非特异性条带引起的，可以尝试提高退火温度或使用热启动PCR酶扩增，超保真Taq酶（热启动型的）效果也很好。。。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
7楼2015-07-06 17:08:21
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myh1205

新虫 (初入文坛)
我最近的也是这样，你解决了嘛？

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8楼2017-06-09 13:09:12
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myh1205

新虫 (初入文坛)
SSR-PCR 杂带很多  求解决方案-1

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9楼2017-06-10 14:06:00
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肖申克的舅叔

金虫 (正式写手)
说实话哈，我觉得如果是sSR引物的话条带炖才更好啊，越有利于分析多态性啊，这又不是为了扩增回收，只要sSR引物扩增条带是稳定存在的，当然是多多益善了

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10楼2017-06-11 10:55:03
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