[求助] 有关细菌生物膜的构建、定量测定和染色观察问题 已有2人参与

小妹最近在体外构建细菌生物膜，并对其定量测定和染色用共聚焦观察。但是由于刚开始做，有一些问题想请教大家，希望知道的大神能给点建议。在这里先谢谢了~！       Q1： 首先是按照文献的办法在体外用96孔板构建生物膜，过程大概就是加入一定浓度的菌悬液，培养若干天，然后吸弃培养基，用灭菌水洗，然后加入1%的结晶紫染色0.5h，吸弃结晶紫，用95%乙醇溶解结晶紫，然后用酶标仪测OD值。但是在实验中，遇到一些问题：1、加入菌悬液后，若干天后吸弃培养基时，发现底部是有一些沉淀，这就是生物膜吗？2、在用灭菌水清洗时，觉得很容易把底部的细菌沉淀吸走，有什么好的办法？3、在用结晶紫染色后，要将结晶紫吸走时，同样也很容易将染色的细菌吸走，感觉这样的方法很不靠谱，想请问各路大神有什么好的办法解决吗？还是这个方法不可行（PS:感觉很多文献中都是这么做的呃o(╯□╰)o）       Q2：第二个问题就是想用形成菌膜的细菌染色后用共聚焦观察，打算用的是InvitrogenLIVE/DEAD®BacLight试剂盒（货号L13152 ），里面是含有两种染色剂，一种是Syto9，可对所有细胞经行染色，另外一种是PI，对死细胞经行染色。若有大侠用过这个试剂盒的，先跪谢了！~。主要的问题就是1、用什么器皿观察好？是用激光共聚焦皿将细菌种在上面，若干天形成菌膜后，然后加入染料关系?还是在孔板中加入菌液，然后加入盖玻片，让菌膜黏附在玻片上，染色染色观察呢？如果是用玻片的话，是要让玻片沉浸在培养基中？还是让玻片悬浮在培养基中呢？2、这个试剂盒是两种染料粉末分装的，分别用2.5ml的水溶解后，然后混合成5ml 的染料，是直接将染料滴在玻片上观察吗？需要固定吗？     以上是目前遇到的问题，有点多，万事开头难，希望知道的大神们能给点建议。这里先跪谢了~ ..

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