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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 做RACE老是出现非特异扩增，求助！
汕头大学海洋科学接受调剂
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青青草allan

银虫 (小有名气)

[求助] 做RACE老是出现非特异扩增，求助！ 已有3人参与

我在做RACE扩增一个基因的全长cDNA，设计的基因特异引物可以扩增出中间的重叠片段（经测序确证），但是5‘和3’RACE总是做不出来。根据已经扩增出的中间片段，设计了5‘和3’RACE引物，能扩增出条带，Maker指示的片段大小也和目的片段大小差不多，但是经切胶回收，连接转化，挑斑，送菌样测序后测回来的序列在NCBI上比对后，发现相似性较高的老是一些别的东西的序列（如某个病毒的基因组，或者是某个东西的核糖体蛋白）。也尝试换过引物，但是要么扩不出东西，要么是空载体，要么是上述那种情况。我用的是试剂盒是SMART™ RACE cDNA Amplification Kit。请有经验的高人指点，不胜感激！

[ Last edited by 西门吹雪170 on 2014-6-28 at 12:44 ]
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爱出者爱返，福往者福来
1楼 2014-06-28 11:47:38
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2014-06-28 19:50:49
你的双链做的怎么样？RNA质量好不好？特异引物设计的退火多少度？测序后能不能拼接？

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2楼2014-06-28 12:07:43
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-28 12:07:43
你的双链做的怎么样？RNA质量好不好？特异引物设计的退火多少度？测序后能不能拼接？

我们实验室是统一提的RNA，做的cDNA，也有别的人在用，也有做出来别的基因的全长的，应该没有问题。避免反复冻融，我们做的5‘和3’cDNA是用小PCR分装的，一直放在-20度，现在已经放了有两个多月。我是在做5个基因的全长，特异引物设计的退火温度都不一样啊，都做出来了，有的800-1000bp的基本上测序的时候都让公司给双向测通拼接了，小于800bp的基本都是让正向测序，没有拼接过。有影响吗？谢谢回帖！
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爱出者爱返，福往者福来
3楼2014-06-30 09:09:15
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
青青草allan: 金币+1, ★有帮助 2014-07-11 21:37:04
青青草allan: 金币+1, ★有帮助 2014-07-11 21:37:52
引用回帖:
3楼: Originally posted by 青青草allan at 2014-06-30 09:09:15
我们实验室是统一提的RNA，做的cDNA，也有别的人在用，也有做出来别的基因的全长的，应该没有问题。避免反复冻融，我们做的5‘和3’cDNA是用小PCR分装的，一直放在-20度，现在已经放了有两个多月。我是在做5个基因 ...

你们的双链cDNA做的好不好？race获得的序列能否与已知片段拼接起来？

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4楼2014-06-30 09:17:05
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-30 09:17:05
你们的双链cDNA做的好不好？race获得的序列能否与已知片段拼接起来？
...

cDNA应该没有问题。迄今为止只得到了一个基因的5‘端序列，和这个基因的已知片段有将近300bp的重叠，可以拼接起来的。
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爱出者爱返，福往者福来
5楼2014-06-30 11:02:40
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
情况跟我好相似啊，我也是RACE做不出来，一测序就是26S核糖体序列！一样的试剂盒
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6楼2014-07-06 13:13:42
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yoyo单眼皮 at 2014-07-06 13:13:42
情况跟我好相似啊，我也是RACE做不出来，一测序就是26S核糖体序列！一样的试剂盒

你扩出来的条带单一吗？我扩出来的条带单一，没有杂带，而且很亮，最后测序回来的结果仍然是其他东西的序列，都不知道该怎么办了。
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爱出者爱返，福往者福来
7楼2014-07-07 21:00:29
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
青青草allan: 金币+1, ★有帮助 2014-07-11 21:38:11
引用回帖:
7楼: Originally posted by 青青草allan at 2014-07-07 21:00:29
你扩出来的条带单一吗？我扩出来的条带单一，没有杂带，而且很亮，最后测序回来的结果仍然是其他东西的序列，都不知道该怎么办了。...

脱靶啦，重新设计引物吧

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8楼2014-07-07 21:43:57
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yoyo单眼皮

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 青青草allan at 2014-07-07 21:00:29
你扩出来的条带单一吗？我扩出来的条带单一，没有杂带，而且很亮，最后测序回来的结果仍然是其他东西的序列，都不知道该怎么办了。...

我也是！！！欲哭无泪！
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9楼2014-07-09 15:43:53
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青青草allan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-07-07 21:43:57
脱靶啦，重新设计引物吧
...

嗯，看来只能换引物了。
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爱出者爱返，福往者福来
10楼2014-07-10 13:05:54
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