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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒，PCR产物双酶切后胶回收不回来？求大神指导！
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匿名

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Thomas_HT
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31楼2014-06-30 21:57:02
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yln819

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30楼: Originally posted by 手指缠胶带 at 2014-06-30 21:52:59
你回收不好   浪费的试剂  这钱都够测序用的了   还不一定有结果   这不是耽误事么？...

导师不这么认为呀，而且测出来不对不也浪费钱吗
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32楼2014-07-01 00:16:47
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yln819

新虫 (正式写手)
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31楼: Originally posted by 手指缠胶带 at 2014-06-30 21:57:02
要是你坚持回收的话  在每步离心前   考虑静置一会（多静置1min-3min）试下     让其溶解充分   离心时洗脱和最后回收就充分  回收的结果可能会好点...

好的，我试一下看看，你一般都是测序吗？
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33楼2014-07-01 00:19:06
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匿名

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Thomas_HT
★ ★
yln819: 金币+2, ★有帮助 2014-07-01 11:17:06
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34楼2014-07-01 08:32:03
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匿名

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Thomas_HT
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35楼2014-07-01 08:36:07
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yln819

新虫 (正式写手)
引用回帖:
35楼: Originally posted by 手指缠胶带 at 2014-07-01 08:36:07
你回收损失太多   然后没结果   但是测序可能出有结果   ；而且测序也得自己比对    错了也能看出来啊   但是我们不是至少能减少损失那一步骤了嘛...

是那么回事，但老师不会那么想的。。。
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36楼2014-07-01 11:16:58
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
yln819: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-07-01 16:11:08
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-03 12:13:48
制胶、电泳、电泳缓冲液、核酸染料的量、琼脂糖的浓度、跑完胶看否看得见，若条带很弱就没有没收的必要，做分子实验要注意细节，有的时候你可能会觉得莫名其妙，重复不出来，实际上是自己的粗心大意，在每一个环节上都不要掉以轻心，即使你做了很久很熟练也不要偷懒，按标准操作规程做，除非有经验比你丰富的予以指导，可以做修改。
关于胶回收我曾经也遇到到写问题，我想需注意以下几点：（个人意见，仅供参考）
1.质粒的量足够 1~2ug，载体的酶切我习惯做CIP，降低自连率
2.PCR多做几管，做小体系就行，比如10ul，PCR完后可以一起跑胶挖胶纯化，胶尽量倒薄些，切胶尽量切少些，但要把目的条带全包括，纯化的时候第一步溶胶要彻底，溶完胶待冷却至常温再挂柱，洗脱的时候，洗脱液65°加热下，这些按说明书上来就行。洗脱体积尽量小些，我一般25ul。纯化后取2ul跑胶看有没有东西，若没有就不要做酶切了，重来
关于PCR产物还有另一种方案，比如10ul体系，P4管，完了合并，取2ul跑胶看有没有目的条带，有就把剩余38ul用PCR清洁试剂盒回收，不需要溶胶这一步，快，回收后取2ul跑胶检测你的目的条带是否还在，可能有杂带，不要紧，有目的条带就行，继续酶切，酶切后跑胶，切胶纯化，把酶切的目的条带回收出来就行，记住每一步最好跑胶看一下，以免重头再来 啊
回收时比较关键的步骤，步步检验，出现问题马上重来，相信自己肯定能做出来，没问题的，加油！
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37楼2014-07-01 15:49:54
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匿名

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Thomas_HT
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38楼2014-07-01 15:50:03
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yln819

新虫 (正式写手)
引用回帖:
37楼: Originally posted by smdsfy at 2014-07-01 15:49:54
制胶、电泳、电泳缓冲液、核酸染料的量、琼脂糖的浓度、跑完胶看否看得见，若条带很弱就没有没收的必要，做分子实验要注意细节，有的时候你可能会觉得莫名其妙，重复不出来，实际上是自己的粗心大意，在每一个环节上 ...

恩恩，好详细呀，谢谢
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39楼2014-07-01 16:11:02
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smdsfy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
39楼: Originally posted by yln819 at 2014-07-01 16:11:02
恩恩，好详细呀，谢谢...

不客气
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40楼2014-07-03 09:40:39
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