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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒，PCR产物双酶切后胶回收不回来？求大神指导！
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952038213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-06-29 17:39:19
yln819: 金币+2, ★有帮助 2014-06-29 19:51:19
试剂盒没问题的话，应该是上样量不够。我最近刚做的酶切回收3000个10000的，上样量20ul，结果条带很浅，割胶回收后只有5.2ng/ul。然后我又50多上样，回收浓度还是很少，不过还好够我连接了。还有建议你下次再提问把胶图贴上，比较好看。我也是菜鸟，共同进步吧

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21楼2014-06-28 18:28:05
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弑者星魂

金虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-06-29 17:39:28
你们回收的时候有没有用双蒸水或TE润洗。。。。老师告诉我们不成功可以稍微加热一下柱子。。。。。个人意见，可能会有不对的地方

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22楼2014-06-28 19:56:52
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yln819

新虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 弑者星魂 at 2014-06-28 19:56:52
你们回收的时候有没有用双蒸水或TE润洗。。。。老师告诉我们不成功可以稍微加热一下柱子。。。。。个人意见，可能会有不对的地方

双蒸水和TE都用过了，而且在65摄氏度下加热过，都没行
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23楼2014-06-29 19:49:53
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yln819

新虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 952038213 at 2014-06-28 18:28:05
试剂盒没问题的话，应该是上样量不够。我最近刚做的酶切回收3000个10000的，上样量20ul，结果条带很浅，割胶回收后只有5.2ng/ul。然后我又50多上样，回收浓度还是很少，不过还好够我连接了。还有建议你下次再提问把 ...

好的，谢谢
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24楼2014-06-29 19:51:12
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匿名

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Thomas_HT
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25楼2014-06-30 09:25:09
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
yln819: 金币+2 2014-06-30 12:39:29
引用回帖:
10楼: Originally posted by yln819 at 2014-06-27 11:51:08
接近3000bp,多少ug没有计算，这个必须算着加吗？...

有关系的。
举个例子。你的质粒10000bp。回收的载体8000bp，片段2000bp。
如果你酶切1ug，那么回收的载体就是8000/10000*1=0.8ug，片段就是0.2ug。
接着切胶回收，假如回收率是80%，那么载体回收的就是0.64ug.加20ul水溶解，浓度是32ng/ul。何况，回收的时候回收率一般没有80%那么高，要小得多。
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26楼2014-06-30 10:44:00
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yln819

新虫 (正式写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 手指缠胶带 at 2014-06-30 09:25:09
直接送去测序就好了

导师不会同意的。。
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27楼2014-06-30 12:40:01
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yln819

新虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-06-30 10:44:00
有关系的。
举个例子。你的质粒10000bp。回收的载体8000bp，片段2000bp。
如果你酶切1ug，那么回收的载体就是8000/10000*1=0.8ug，片段就是0.2ug。
接着切胶回收，假如回收率是80%，那么载体回收的就是0.64ug.加 ...

哦哦，知道了，谢谢
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28楼2014-06-30 12:41:18
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by yln819 at 2014-06-30 12:41:18
哦哦，知道了，谢谢...

不客气
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29楼2014-06-30 16:16:40
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匿名

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Thomas_HT
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30楼2014-06-30 21:52:59
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