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yln819

新虫 (正式写手)

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[求助] 质粒，PCR产物双酶切后胶回收不回来？求大神指导！已有9人参与

我质粒、PCR产物双酶切后回收不回来，切胶的时候质粒是用了五个泳道的胶，pcr用了三个泳道的，可回收后还是没有条带！求指导！谢谢！

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1楼 2014-06-27 10:12:37

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smdsfy

铜虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
yln819: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-07-01 16:11:08
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-03 12:13:48

制胶、电泳、电泳缓冲液、核酸染料的量、琼脂糖的浓度、跑完胶看否看得见，若条带很弱就没有没收的必要，做分子实验要注意细节，有的时候你可能会觉得莫名其妙，重复不出来，实际上是自己的粗心大意，在每一个环节上都不要掉以轻心，即使你做了很久很熟练也不要偷懒，按标准操作规程做，除非有经验比你丰富的予以指导，可以做修改。
关于胶回收我曾经也遇到到写问题，我想需注意以下几点：（个人意见，仅供参考）
1.质粒的量足够 1~2ug，载体的酶切我习惯做CIP，降低自连率
2.PCR多做几管，做小体系就行，比如10ul，PCR完后可以一起跑胶挖胶纯化，胶尽量倒薄些，切胶尽量切少些，但要把目的条带全包括，纯化的时候第一步溶胶要彻底，溶完胶待冷却至常温再挂柱，洗脱的时候，洗脱液65°加热下，这些按说明书上来就行。洗脱体积尽量小些，我一般25ul。纯化后取2ul跑胶看有没有东西，若没有就不要做酶切了，重来
关于PCR产物还有另一种方案，比如10ul体系，P4管，完了合并，取2ul跑胶看有没有目的条带，有就把剩余38ul用PCR清洁试剂盒回收，不需要溶胶这一步，快，回收后取2ul跑胶检测你的目的条带是否还在，可能有杂带，不要紧，有目的条带就行，继续酶切，酶切后跑胶，切胶纯化，把酶切的目的条带回收出来就行，记住每一步最好跑胶看一下，以免重头再来啊
回收时比较关键的步骤，步步检验，出现问题马上重来，相信自己肯定能做出来，没问题的，加油！