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用DTNB法测定巯基数目的详细protocol，以GSH作标准曲线 已有1人参与
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| 近期要用DTNB法测定某蛋白上巯基的数目，用谷胱甘肽做标准曲线，酶标仪测定。求详细的步骤？ |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
zhuqianabc(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-06-23 08:27:38
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详细步骤已经上传; http://www.docin.com/p-65138485.html |
2楼2014-06-21 16:14:17
1012203014
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测定总巯基含量时，15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液（0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0）。测定自由巯基含量时，15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中，而后加入50 μL Ellman 试剂 （DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液，4 mg/mL），在25℃条件下保温反应60 min, 离心（5000 g, 15 min），上清液在412 nm 处测定吸光值，以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。 巯基含量的计算公式如下： SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C 式中：A —除去试剂空白后样品的吸光度值 D—稀释倍数 C—样品浓度（mg/mL） 问题1：上述公式中稀释倍数D是怎么算的（具体的式子），如果完全按照上述方法是不是就是1？ 问题2：我测的物质为毛发固体样品，样品在412nm处的吸收峰并不是最大的，这样会有影响吗？ 问题3：由于毛发样品中含有非水溶性蛋白，又没哟测量二硫键含量的更好的方法 如能解答，必当重谢！  |
3楼2015-10-07 21:35:28
