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生院深似海

金虫 (初入文坛)

[求助] 有没有虫友做过探针类的荧光定量pcr？或者了解细菌的16srDNA的 进来探讨下啊~谢谢 已有1人参与

我想问问大家金黄色葡萄球菌和大肠的16srDNA是单拷贝的吗?用来做探针特异性高不？
有做过探针类实时定量pcr的吗？怎么选择基因片段，使得设计探针特异性更高呢？探针应该是送公司帮着制备吧？那送公司之前，有没有什么检验方法，知道自己选择的序列特异性很高呢（普通pcr检验？或者syb green I检验？）？没做过这个领域，求大神指点~！！谢谢！！
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1楼 2014-06-18 11:14:35
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cxb-abc

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王丹2013 at 2014-06-18 21:46:34
细菌16S rDNA相当保守，所以经常被用作荧光定量的内参基因。
荧光定量的探针与其他引物设计差不多，只是对引物要求高一些，不能任何有错配，引物二聚体以及发夹结构，退火温度最好在55℃，长度不要太长，150-250 b ...

16SrDNA确实相当保守，但是要是做不同处理之间的16SrDNA的qPCR,用什么做内参合适？求建议？
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3楼2014-06-22 16:06:02
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王丹2013

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
生院深似海: 金币+5, ★有帮助 2014-06-19 10:20:10
细菌16S rDNA相当保守，所以经常被用作荧光定量的内参基因。
荧光定量的探针与其他引物设计差不多，只是对引物要求高一些，不能任何有错配，引物二聚体以及发夹结构，退火温度最好在55℃，长度不要太长，150-250 bp比较好，尽量不要超过400 bp.
做荧光定量之前要先用普通PCR检验一下特异性。
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2楼2014-06-18 21:46:34
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王丹2013

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by cxb-abc at 2014-06-22 16:06:02
16SrDNA确实相当保守，但是要是做不同处理之间的16SrDNA的qPCR,用什么做内参合适？求建议？...

不知道你是什么处理，但是你确定你要定量的就是16S rRNA基因本身？这有什么意义呢？一般情况下16S rRNA基因都是组成型表达，不同处理之间表达量基本不会有太大差异。如果确定要做这个的话那就要选其他组成型表达的基因作内参了。
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4楼2014-06-22 21:51:47
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cxb-abc

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王丹2013 at 2014-06-22 21:51:47
不知道你是什么处理，但是你确定你要定量的就是16S rRNA基因本身？这有什么意义呢？一般情况下16S rRNA基因都是组成型表达，不同处理之间表达量基本不会有太大差异。如果确定要做这个的话那就要选其他组成型表达的 ...

多谢，不过是查了很多文献，好像都是用探针做的。
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5楼2014-06-23 10:45:37
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