应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » PCR扩增跑胶
202/2返回列表上一页12
查看: 1875  |  回复: 19
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-11 10:38:26
非常感谢您的帮助。
我从hepG2细胞中提取RNA，经反转录得到cDNA，然后PCR，反应条件是：94度 1min；（94度 30sec,55度 30 sec,72度 5min)*30个循环;72度 10min
hTERT F1 Tm=60.0度
          R1 Tm=61.9度
麻烦 ...

你把退火温度从54~64度做个梯度看下，从Tm来看用60度应该比较合适，退火温度低的话引物自身容易互补结合。有梯度PCR仪一次就可以做完了。
赞一下 回复此楼
11楼2014-06-11 11:10:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-11 11:10:34
你把退火温度从54~64度做个梯度看下，从Tm来看用60度应该比较合适，退火温度低的话引物自身容易互补结合。有梯度PCR仪一次就可以做完了。...

还有，72度延伸时间不要那么长，30s~1min足矣，你这个基因目的产物长度好像只有200多bp.
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

伊梦青lhq
12楼2014-06-11 11:12:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-06-11 09:18:13
某些基因的mRNA太少，因细胞而异。...

hepG2人肝癌细胞，应该是表达hTERT的吧？
赞一下 回复此楼
13楼2014-06-11 16:11:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-11 16:11:54
hepG2人肝癌细胞，应该是表达hTERT的吧？...

端粒酶逆转录酶，表达量少
赞一下 回复此楼
14楼2014-06-11 16:28:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-11 11:12:17
还有，72度延伸时间不要那么长，30s~1min足矣，你这个基因目的产物长度好像只有200多bp....

非常非常感谢您的帮助和建议，我试一下。
我用hepG2细胞做western blot，可以看到hTERT蛋白的条带，是否可以说明这个hepG2细胞是可以表达hTERT？
另外我想问一下您是用什么方法看出这个引物没问题的呢？
我用一个在线软件看了一下
http://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/MFEprimer-2.0/，
怎么得到的序列并不是hTERT（ ttaggg ）的重复序列呢，或者是我看不懂其结果中seq2+seq1中间那一段序列，这指的是什么呢？

谢谢！
赞一下 回复此楼
15楼2014-06-11 21:26:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-06-11 16:28:41
端粒酶逆转录酶，表达量少...

但是肿瘤细胞中人端粒逆转录酶是高效表达的，80%左右，正常细胞中表达很少的。
赞一下 回复此楼
16楼2014-06-13 08:23:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-11 21:26:53
非常非常感谢您的帮助和建议，我试一下。
我用hepG2细胞做western blot，可以看到hTERT蛋白的条带，是否可以说明这个hepG2细胞是可以表达hTERT？
另外我想问一下您是用什么方法看出这个引物没问题的呢？
我用一 ...

检查引物我用的是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
赞一下 回复此楼
17楼2014-06-20 13:58:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-20 13:58:39
检查引物我用的是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/...

根据您的建议，我做了退火梯度，温度分别是55,56,57,58,59,60，
20ul反应体系，反应条件是：94度 1min；（94度 30sec,53度 30 sec,72度 2min)*34个循环;72度 10min，并换了一种dNTP mixture ，由于之前跑的没有条带，我就稍稍增大了点模板量，由原来4ul/25ui增加为4ul/20ui跑胶结果就是上图。
hTERT F1 Tm=60.0度
          R1 Tm=61.9度
高兴的是它有条带了，但是结果不好，有弥散只有退火温度在55,56时条带还比较明显。
我用的是TAE浓缩液差不多一年了，稀释后跑胶。
Mg离子是包含在试剂盒的buffer中，不是另外添加的。

高手帮忙再指导一下，是什么原因呢？谢谢啦！
赞一下 回复此楼
18楼2014-06-21 11:07:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-20 13:58:39
检查引物我用的是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/...

根据您的建议，我做了退火梯度，温度分别是55,56,57,58,59,60，
20ul反应体系，反应条件是：94度 1min；（94度 30sec,53度 30 sec,72度 2min)*34个循环;72度 10min，并换了一种dNTP mixture ，由于之前跑的没有条带，我就稍稍增大了点模板量，由原来4ul/25ui增加为4ul/20ui跑胶结果就是上图。
hTERT F1 Tm=60.0度
          R1 Tm=61.9度
高兴的是它有条带了，但是结果不好，有弥散，只有退火温度在55,56时条带还比较明显。
我用的是TAE浓缩液差不多一年了，稀释后跑胶。
Mg离子是包含在试剂盒的buffer中，不是另外添加的。

高手帮忙再指导一下，是什么原因呢？谢谢啦！
PCR扩增跑胶
20140621112523.jpg
赞一下 回复此楼
19楼2014-06-21 11:26:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-21 11:26:15
根据您的建议，我做了退火梯度，温度分别是55,56,57,58,59,60，
20ul反应体系，反应条件是：94度 1min；（94度 30sec,53度 30 sec,72度 2min)*34个循环;72度 10min，并换了一种dNTP mixture ，由于之前跑的没有条 ...

条带是否是200多bp（目的条带位置）？点个marker看一下marker跑得怎样。
赞一下 回复此楼
20楼2014-06-21 13:21:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 伊梦青lhq 的主题更新
202/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 0XLacIJUOj8D 2026-08-24 7/350 2026-08-25 03:24 by BZKMTicpDhFj
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 0XLacIJUOj8D 2026-08-24 3/150 2026-08-25 01:47 by BZKMTicpDhFj
[基金申请] 明天应该可查了！？ +5 chengyan1220 2026-08-23 5/250 2026-08-24 23:28 by 我4大白菜
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +7 图啦图啦 2026-08-24 8/400 2026-08-24 22:00 by maomao_da
[论文投稿] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 0XLacIJUOj8D 2026-08-24 3/150 2026-08-24 21:59 by BZKMTicpDhFj
[基金申请] 人气不行了 +10 fansofjerry 2026-08-21 10/500 2026-08-24 21:03 by zhanghaozhu
[基金申请] 我面上完蛋了 +9 且听虎啸 2026-08-20 10/500 2026-08-24 20:08 by 苦寒来香
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +21 koalala 2026-08-24 24/1200 2026-08-24 19:25 by 家与远方
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +14 ziyangfang 2026-08-19 17/850 2026-08-24 18:37 by 哈哈蛤？
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +17 羊腰板 2026-08-21 19/950 2026-08-24 16:52 by iaeyuan
[基金申请] 估计是周四 +4 archvillain 2026-08-18 4/200 2026-08-24 13:53 by zzuzxg
[基金申请] 朋友圈看到的 +7 wangzilk 2026-08-18 9/450 2026-08-24 10:50 by cmrandy
[基金申请] 什么时候开奖？ +10 CrisMessi 2026-08-18 11/550 2026-08-24 06:50 by 开心的小狮子
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭