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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-11 10:38:26
非常感谢您的帮助。
我从hepG2细胞中提取RNA，经反转录得到cDNA，然后PCR，反应条件是：94度 1min；（94度 30sec,55度 30 sec,72度 5min)*30个循环;72度 10min
hTERT F1 Tm=60.0度
          R1 Tm=61.9度
麻烦 ...

你把退火温度从54~64度做个梯度看下，从Tm来看用60度应该比较合适，退火温度低的话引物自身容易互补结合。有梯度PCR仪一次就可以做完了。
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11楼2014-06-11 11:10:34
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-11 11:10:34
你把退火温度从54~64度做个梯度看下，从Tm来看用60度应该比较合适，退火温度低的话引物自身容易互补结合。有梯度PCR仪一次就可以做完了。...

还有，72度延伸时间不要那么长，30s~1min足矣，你这个基因目的产物长度好像只有200多bp.
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伊梦青lhq
12楼2014-06-11 11:12:17
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-06-11 09:18:13
某些基因的mRNA太少，因细胞而异。...

hepG2人肝癌细胞，应该是表达hTERT的吧？
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13楼2014-06-11 16:11:54
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-11 16:11:54
hepG2人肝癌细胞，应该是表达hTERT的吧？...

端粒酶逆转录酶，表达量少
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14楼2014-06-11 16:28:41
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-11 11:12:17
还有，72度延伸时间不要那么长，30s~1min足矣，你这个基因目的产物长度好像只有200多bp....

非常非常感谢您的帮助和建议，我试一下。
我用hepG2细胞做western blot，可以看到hTERT蛋白的条带，是否可以说明这个hepG2细胞是可以表达hTERT？
另外我想问一下您是用什么方法看出这个引物没问题的呢？
我用一个在线软件看了一下
http://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/MFEprimer-2.0/，
怎么得到的序列并不是hTERT（ ttaggg ）的重复序列呢，或者是我看不懂其结果中seq2+seq1中间那一段序列，这指的是什么呢？

谢谢！
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15楼2014-06-11 21:26:53
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-06-11 16:28:41
端粒酶逆转录酶，表达量少...

但是肿瘤细胞中人端粒逆转录酶是高效表达的，80%左右，正常细胞中表达很少的。
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16楼2014-06-13 08:23:17
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-11 21:26:53
非常非常感谢您的帮助和建议，我试一下。
我用hepG2细胞做western blot，可以看到hTERT蛋白的条带，是否可以说明这个hepG2细胞是可以表达hTERT？
另外我想问一下您是用什么方法看出这个引物没问题的呢？
我用一 ...

检查引物我用的是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
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17楼2014-06-20 13:58:39
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-20 13:58:39
检查引物我用的是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/...

根据您的建议，我做了退火梯度，温度分别是55,56,57,58,59,60，
20ul反应体系，反应条件是：94度 1min；（94度 30sec,53度 30 sec,72度 2min)*34个循环;72度 10min，并换了一种dNTP mixture ，由于之前跑的没有条带，我就稍稍增大了点模板量，由原来4ul/25ui增加为4ul/20ui跑胶结果就是上图。
hTERT F1 Tm=60.0度
          R1 Tm=61.9度
高兴的是它有条带了，但是结果不好，有弥散只有退火温度在55,56时条带还比较明显。
我用的是TAE浓缩液差不多一年了，稀释后跑胶。
Mg离子是包含在试剂盒的buffer中，不是另外添加的。

高手帮忙再指导一下，是什么原因呢？谢谢啦！
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18楼2014-06-21 11:07:43
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-20 13:58:39
检查引物我用的是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/...

根据您的建议，我做了退火梯度，温度分别是55,56,57,58,59,60，
20ul反应体系，反应条件是：94度 1min；（94度 30sec,53度 30 sec,72度 2min)*34个循环;72度 10min，并换了一种dNTP mixture ，由于之前跑的没有条带，我就稍稍增大了点模板量，由原来4ul/25ui增加为4ul/20ui跑胶结果就是上图。
hTERT F1 Tm=60.0度
          R1 Tm=61.9度
高兴的是它有条带了，但是结果不好，有弥散，只有退火温度在55,56时条带还比较明显。
我用的是TAE浓缩液差不多一年了，稀释后跑胶。
Mg离子是包含在试剂盒的buffer中，不是另外添加的。

高手帮忙再指导一下，是什么原因呢？谢谢啦！
PCR扩增跑胶
20140621112523.jpg
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19楼2014-06-21 11:26:15
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-21 11:26:15
根据您的建议，我做了退火梯度，温度分别是55,56,57,58,59,60，
20ul反应体系，反应条件是：94度 1min；（94度 30sec,53度 30 sec,72度 2min)*34个循环;72度 10min，并换了一种dNTP mixture ，由于之前跑的没有条 ...

条带是否是200多bp（目的条带位置）？点个marker看一下marker跑得怎样。
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20楼2014-06-21 13:21:35
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