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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-11 10:38:26
非常感谢您的帮助。
我从hepG2细胞中提取RNA,经反转录得到cDNA,然后PCR,反应条件是:94度 1min;(94度 30sec,55度 30 sec,72度 5min)*30个循环;72度 10min
hTERT F1 Tm=60.0度
          R1 Tm=61.9度
麻烦 ...

你把退火温度从54~64度做个梯度看下,从Tm来看用60度应该比较合适,退火温度低的话引物自身容易互补结合。有梯度PCR仪一次就可以做完了。
11楼2014-06-11 11:10:34
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-11 11:10:34
你把退火温度从54~64度做个梯度看下,从Tm来看用60度应该比较合适,退火温度低的话引物自身容易互补结合。有梯度PCR仪一次就可以做完了。...

还有,72度延伸时间不要那么长,30s~1min足矣,你这个基因目的产物长度好像只有200多bp.

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12楼2014-06-11 11:12:17
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-06-11 09:18:13
某些基因的mRNA太少,因细胞而异。...

hepG2人肝癌细胞,应该是表达hTERT的吧?
13楼2014-06-11 16:11:54
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

引用回帖:
13楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-11 16:11:54
hepG2人肝癌细胞,应该是表达hTERT的吧?...

端粒酶逆转录酶,表达量少
14楼2014-06-11 16:28:41
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-11 11:12:17
还有,72度延伸时间不要那么长,30s~1min足矣,你这个基因目的产物长度好像只有200多bp....

非常非常感谢您的帮助和建议,我试一下。
我用hepG2细胞做western blot,可以看到hTERT蛋白的条带,是否可以说明这个hepG2细胞是可以表达hTERT?
另外我想问一下您是用什么方法看出这个引物没问题的呢?
我用一个在线软件看了一下
http://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/MFEprimer-2.0/
怎么得到的序列并不是hTERT( ttaggg )的重复序列呢,或者是我看不懂其结果中seq2+seq1中间那一段序列,这指的是什么呢?

谢谢!
15楼2014-06-11 21:26:53
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
14楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-06-11 16:28:41
端粒酶逆转录酶,表达量少...

但是肿瘤细胞中人端粒逆转录酶是高效表达的,80%左右,正常细胞中表达很少的。
16楼2014-06-13 08:23:17
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-11 21:26:53
非常非常感谢您的帮助和建议,我试一下。
我用hepG2细胞做western blot,可以看到hTERT蛋白的条带,是否可以说明这个hepG2细胞是可以表达hTERT?
另外我想问一下您是用什么方法看出这个引物没问题的呢?
我用一 ...

检查引物我用的是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
17楼2014-06-20 13:58:39
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
17楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-20 13:58:39
检查引物我用的是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/...

根据您的建议,我做了退火梯度,温度分别是55,56,57,58,59,60,
20ul反应体系,反应条件是:94度 1min;(94度 30sec,53度 30 sec,72度 2min)*34个循环;72度 10min,并换了一种dNTP mixture ,由于之前跑的没有条带,我就稍稍增大了点模板量,由原来4ul/25ui增加为4ul/20ui跑胶结果就是上图。
hTERT F1 Tm=60.0度
          R1 Tm=61.9度
高兴的是它有条带了,但是结果不好,有弥散只有退火温度在55,56时条带还比较明显。
我用的是TAE浓缩液差不多一年了,稀释后跑胶。
Mg离子是包含在试剂盒的buffer中,不是另外添加的。

高手帮忙再指导一下,是什么原因呢?谢谢啦!
18楼2014-06-21 11:07:43
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伊梦青lhq

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
17楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-20 13:58:39
检查引物我用的是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/...

根据您的建议,我做了退火梯度,温度分别是55,56,57,58,59,60,
20ul反应体系,反应条件是:94度 1min;(94度 30sec,53度 30 sec,72度 2min)*34个循环;72度 10min,并换了一种dNTP mixture ,由于之前跑的没有条带,我就稍稍增大了点模板量,由原来4ul/25ui增加为4ul/20ui跑胶结果就是上图。
hTERT F1 Tm=60.0度
          R1 Tm=61.9度
高兴的是它有条带了,但是结果不好,有弥散,只有退火温度在55,56时条带还比较明显。
我用的是TAE浓缩液差不多一年了,稀释后跑胶。
Mg离子是包含在试剂盒的buffer中,不是另外添加的。

高手帮忙再指导一下,是什么原因呢?谢谢啦!
PCR扩增跑胶
20140621112523.jpg

19楼2014-06-21 11:26:15
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
19楼: Originally posted by 伊梦青lhq at 2014-06-21 11:26:15
根据您的建议,我做了退火梯度,温度分别是55,56,57,58,59,60,
20ul反应体系,反应条件是:94度 1min;(94度 30sec,53度 30 sec,72度 2min)*34个循环;72度 10min,并换了一种dNTP mixture ,由于之前跑的没有条 ...

条带是否是200多bp(目的条带位置)?点个marker看一下marker跑得怎样。
20楼2014-06-21 13:21:35
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