应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » T载体连接问题，急求！
111/2返回列表12下一页
查看: 1775  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

richart

金虫 (正式写手)

[交流] T载体连接问题，急求！

我要连接的基因2.6Kb左右，一直连不上T载体（TaKaRa PMD19-T），用的是Pfu扩的基因，转化菌长出的有不少白斑，挑了十几个都是假阳性。请高手指点一下具体怎么操作，连接效率高一些！！
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2008-03-19 15:48:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

傻子

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来
Pfu扩增的PCR产物是没有A尾的，需要再加A才能连T载体。或者PFU扩增结束再用普通Taq 72度延长半小时
赞一下(10人) 回复此楼
1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能，国家免检优质产品。
2楼2008-03-19 18:01:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

totoro一家亲

铜虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 关注,.
楼上说得没错，不过不用那么长时间。
在PCR反应后，补充一点dATP，或者dNTP也行，再加入一点普通Taq酶，72度10分钟就足够了。
我一直这么做的，效果挺好。最长连接过3.6Kb的插入片段
赞一下(10人) 回复此楼
3楼2008-03-19 18:33:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

annwt

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 关注,.
有假阳性说明载体，连接酶都没有问题，感受态也可以。那问题就有可能是Puf酶的产物加A问题。
Puf产物的回收一定干净，不能有干扰Taq酶的东西，
加A产物纯化后快速连接，不要放置，A易掉。
大片段连接实在不行用超感。
慢慢分析别着急，问题会解决的。

[ Last edited by annwt on 2008-3-19 at 19:09 ]
赞一下(10人) 回复此楼
4楼2008-03-19 19:07:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人
用Taq plus 吧，省点事。
赞一下 回复此楼
细推物理须行乐。
5楼2008-03-19 22:10:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

elton_monkey

银虫 (初入文坛)
pfu好想不能加A吧，应该之后用个加A试剂盒在尾巴上加A再连接吧
赞一下 回复此楼
6楼2008-03-19 22:56:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liumikewolf

金虫 (小有名气)
请问如何判断是假阳性的呢？酶切电泳还是PCR?
赞一下 回复此楼
7楼2008-03-20 09:10:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hotdunk

金虫 (正式写手)
P完补加其他Taq，保温加尾~
赞一下 回复此楼
爱情来得快去得也快，只有猪肉卷是永恒的！
8楼2008-03-20 10:10:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hotdunk

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by liumikewolf at 2008-3-20 09:10:
请问如何判断是假阳性的呢？酶切电泳还是PCR?

都可以，酶切相对方便一点点~
赞一下 回复此楼
爱情来得快去得也快，只有猪肉卷是永恒的！
9楼2008-03-20 10:11:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王者之心

爱莫能助    跟着学习一下
赞一下 回复此楼
10楼2008-06-09 23:41:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 richart 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 6/300 2026-11-05 18:11 by My20PsvIExYO
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 6/300 2026-11-05 18:00 by My20PsvIExYO
[考研] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 11/550 2026-11-05 17:58 by My20PsvIExYO
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 13/650 2026-11-05 17:47 by My20PsvIExYO
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 kvewwGtKktqB 2026-11-04 8/400 2026-11-05 17:47 by My20PsvIExYO
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 8/400 2026-11-05 17:38 by My20PsvIExYO
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 14/700 2026-11-05 17:36 by My20PsvIExYO
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 11/550 2026-11-05 17:36 by My20PsvIExYO
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +5 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 10/500 2026-11-05 17:36 by My20PsvIExYO
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 9/450 2026-11-05 17:26 by My20PsvIExYO
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 16/800 2026-11-05 17:25 by My20PsvIExYO
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 9/450 2026-11-05 17:25 by My20PsvIExYO
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 19/950 2026-11-05 17:25 by My20PsvIExYO
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 13/650 2026-11-05 17:15 by My20PsvIExYO
[基金申请] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 7/350 2026-11-05 16:08 by My20PsvIExYO
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 7/350 2026-11-05 16:08 by My20PsvIExYO
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 10/500 2026-11-05 15:24 by My20PsvIExYO
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 9/450 2026-11-05 15:13 by My20PsvIExYO
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-05 11:10 by PYZmcHr5kSaq
[基金申请] 各位基础老师们，看完中央《从严治党》的决定后，对学术界更加有信心了吧 +5 iaeyuan 2026-11-01 5/250 2026-11-04 14:43 by jinchengzi
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭