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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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richart

金虫 (正式写手)

[交流] T载体连接问题,急求!

我要连接的基因2.6Kb左右,一直连不上T载体(TaKaRa PMD19-T),用的是Pfu扩的基因,转化菌长出的有不少白斑,挑了十几个都是假阳性。请高手指点一下具体怎么操作,连接效率高一些!!
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人

用Taq plus 吧,省点事。
细推物理须行乐。
5楼2008-03-19 22:10:27
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傻子

木虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来
Pfu扩增的PCR产物是没有A尾的,需要再加A才能连T载体。或者PFU扩增结束再用普通Taq 72度延长半小时
1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能,国家免检优质产品。
2楼2008-03-19 18:01:38
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 关注,.
楼上说得没错,不过不用那么长时间。
在PCR反应后,补充一点dATP,或者dNTP也行,再加入一点普通Taq酶,72度10分钟就足够了。
我一直这么做的,效果挺好。最长连接过3.6Kb的插入片段
3楼2008-03-19 18:33:28
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annwt

木虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 关注,.
有假阳性说明载体,连接酶都没有问题,感受态也可以。那问题就有可能是Puf酶的产物加A问题。
Puf产物的回收一定干净,不能有干扰Taq酶的东西,
加A产物纯化后快速连接,不要放置,A易掉。
大片段连接实在不行用超感。
慢慢分析别着急,问题会解决的。

[ Last edited by annwt on 2008-3-19 at 19:09 ]
4楼2008-03-19 19:07:59
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