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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » T载体连接问题，急求！
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richart

金虫 (正式写手)

[交流] T载体连接问题，急求！

我要连接的基因2.6Kb左右，一直连不上T载体（TaKaRa PMD19-T），用的是Pfu扩的基因，转化菌长出的有不少白斑，挑了十几个都是假阳性。请高手指点一下具体怎么操作，连接效率高一些！！
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1楼 2008-03-19 15:48:58
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liumikewolf

金虫 (小有名气)
请问如何判断是假阳性的呢？酶切电泳还是PCR?
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7楼2008-03-20 09:10:43
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傻子

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 欢迎常来
Pfu扩增的PCR产物是没有A尾的，需要再加A才能连T载体。或者PFU扩增结束再用普通Taq 72度延长半小时
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1984年中国制造,长173CM,净重64kg,采用人工智能，国家免检优质产品。
2楼2008-03-19 18:01:38
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totoro一家亲

铜虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 关注,.
楼上说得没错，不过不用那么长时间。
在PCR反应后，补充一点dATP，或者dNTP也行，再加入一点普通Taq酶，72度10分钟就足够了。
我一直这么做的，效果挺好。最长连接过3.6Kb的插入片段
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3楼2008-03-19 18:33:28
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annwt

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):xiexie 关注,.
有假阳性说明载体，连接酶都没有问题，感受态也可以。那问题就有可能是Puf酶的产物加A问题。
Puf产物的回收一定干净，不能有干扰Taq酶的东西，
加A产物纯化后快速连接，不要放置，A易掉。
大片段连接实在不行用超感。
慢慢分析别着急，问题会解决的。

[ Last edited by annwt on 2008-3-19 at 19:09 ]
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4楼2008-03-19 19:07:59
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