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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » Western曝光后无条带，跪求指教！！！
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kingsa: 金币+5, ★★★很有帮助, 万分感谢 2014-05-11 20:15:37
按照以下方法开始排除吧：1、蛋白跑胶后，胶用卡马斯亮蓝染色，如没有上色问题出在跑胶的过程中或蛋有问题，蛋白检测含量，要是跑胶问题就自己查查文献。2、转膜后把膜和胶都考马斯亮蓝染色，看看有没有蛋白，要是纤维膜上有蛋白，说明转膜没问题。3、接下来就是抗体孵育了，本人建议直接作用actin，时间段，内参结果出得快，按内参说明书要求孵育（一般不会出问题）。4、曝光，定显影液需要全部新配置，曝光的时肉眼都能看得见发光。5、1.2步没问题，4步不出结果，3步换其它同学的内参，换了还不出结果4步有问题。自己摸索吧。6、内参要是出了，但是不出你的目标蛋白，赶紧买更贵的抗体吧。否则很难毕业了。
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11楼2014-05-09 21:46:04
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毛线线爱科研

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有可能是蛋白完全没有进入到分离胶内，你可以试一试将转过膜的胶用染色液染上一下，理论上胶上的蛋白不会完全的到膜上。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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12楼2014-05-10 08:21:43
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daibingling

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by kingsa at 2014-05-09 13:54:45
我新订的ECL曝光液，还是现用现配的...

用丽春红染膜
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13楼2014-05-10 08:43:26
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kingsa

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 姐妹染色体 at 2014-05-09 16:44:51
二抗1:2500试试，转完膜用丽春红染下看看，还有曝光时间有点短吧

我曝光时间在30s时曝不出来，就30s慢慢往上加，一直加到300s，条带都没什么变化……

我今天重新做，刚刚才转膜，等会儿我用李春红染下，在把一抗和二抗的浓度再提高，希望能曝出来。
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随心而动，如风自在
14楼2014-05-10 10:21:15
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sunrq516516

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kingsa at 2014-05-09 15:53:13
转膜后怎么染膜啊？求指教...

用丽春红，直接把膜放在丽春红里，然后用TBST洗一下就能看了。正常的情况是可以看到一个个条带的。但是分子量过大可能就不容易看出来。
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Permanent head Damage
15楼2014-05-10 19:21:27
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kingsa

木虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by sunrq516516 at 2014-05-10 19:21:27
用丽春红，直接把膜放在丽春红里，然后用TBST洗一下就能看了。正常的情况是可以看到一个个条带的。但是分子量过大可能就不容易看出来。...

我这两天把转好的膜用TBST洗涤3便后浸于丽春红中震摇10min，再用TBST洗后发现膜上除了marker还是没有条带。这是不是说明电泳或电转出了问题呢？
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随心而动，如风自在
16楼2014-05-11 20:14:42
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sunrq516516

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by kingsa at 2014-05-11 22:14:42
我这两天把转好的膜用TBST洗涤3便后浸于丽春红中震摇10min，再用TBST洗后发现膜上除了marker还是没有条带。这是不是说明电泳或电转出了问题呢？...

(⊙v⊙)嗯……我们转后不洗直接扔在丽春红里。而且不用那么久，漂两漂就出来了……话说你有染色后的照片可以看下吗？因为没有条带有各种情况……所以如果有图可以看一下就是最好啦。

你是染了整个膜都没有一条带吗？低分子量的有出来么？高分子量看不出带很正常，但如果低分子量没出来就很奇怪了。marker的形状正常吗？听上去比较像转膜的问题。

换其他内参也是可以试试的，不过现在看来真的是转膜或者电泳出问题...你的转膜条件是什么？用的是什么膜？
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Permanent head Damage
17楼2014-05-12 14:17:58
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kingsa

木虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by sunrq516516 at 2014-05-12 14:17:58
(⊙v⊙)嗯……我们转后不洗直接扔在丽春红里。而且不用那么久，漂两漂就出来了……话说你有染色后的照片可以看下吗？因为没有条带有各种情况……所以如果有图可以看一下就是最好啦。

你是染了整个膜都没有一条带 ...

我转膜用的PVDF膜，目的蛋白(18KD)0.22μm，beta-actin0.45μm
300mA湿转90min
转膜后，膜上的条带都是非常清晰的



今天转膜后，我重新用丽春红染色，膜上的条带很清晰，marker的形状也正常。不过似乎结合得不太好，TBST洗了5min左右就洗干净了，接下来的洗涤液都挺澄清的。这正常吗？
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随心而动，如风自在
18楼2014-05-12 16:44:27
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sunrq516516

金虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by kingsa at 2014-05-12 18:44:27
我转膜用的PVDF膜，目的蛋白(18KD)0.22μm，beta-actin0.45μm
300mA湿转90min
转膜后，膜上的条带都是非常清晰的



今天转膜后，我重新用丽春红染色，膜上的条带很清晰，marker的形状也正常。不过似乎结合 ...

咕~~(╯﹏╰)……虽然我不知道用固定电流转膜的条件……但应该不会是条带穿过膜了……

下面的情况是很狠正常的，不是结合不太好，只是你把染料洗下来了而已……蛋白还在上面的，理论上。那说明转膜还是挺好的。一般我们染完色就洗一两次，把红色洗掉后就立刻开始blocking了。不会洗很久。

那明天可以期待出结果吗~~？还是你们是一天做完全部……
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kingsa
Permanent head Damage
19楼2014-05-12 20:32:12
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kingsa

木虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
19楼: Originally posted by sunrq516516 at 2014-05-12 20:32:12
咕~~(╯﹏╰)……虽然我不知道用固定电流转膜的条件……但应该不会是条带穿过膜了……

下面的情况是很狠正常的，不是结合不太好，只是你把染料洗下来了而已……蛋白还在上面的，理论上。那说明转膜还是挺好的。 ...

我明天中午去曝光。

今天转膜的时候，我放了两层膜，然后分步做染色。靠近胶的那张膜上marker条带很清晰，染色后的条带也很明显；另一张上只隐约有些条带，几乎是空白的。应该不会转膜过度吧。

我想今天应该转膜没问题，就把抗体浓度提高了再孵育过夜，明天再曝光，看到底是哪步出了问题

期待明天出结果ing……

万分感谢你这几天的帮助！
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随心而动，如风自在
20楼2014-05-12 20:56:15
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