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kingsa

木虫 (正式写手)

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[求助] Western曝光后无条带，跪求指教！！！已有12人参与

最近几次Wetern Blot曝光后，发现只有膜的四周有些黑色，中间完全没有条带。
跪求各位大神指教！！！

曝光条带说明：
            前两条分别为12%和15%分离胶分离的目的条带，只有膜的四周有些黑色，中间完全没有条带
            后两条分别为12%和15%分离胶分离的β-actin条带；前者只有膜的四周有些黑色而中间完全没有条带，后者完全曝不出来

实验条件说明：
               配胶试剂和marker应该没有问题，电泳液、电转液、TBST等试剂都是新配。
               转膜之后，膜上的marker条带非常清晰，转膜应该没有问题的。
               目的蛋白分子量为18KD，我剪的膜覆盖了marker  10-25 KD；β-actin分子量为43KD，我剪的膜覆盖了marker  35-55 KD
               目的蛋白抗体购自Santa Cruz，给的稀释比例建议是100-1000，我用的是1：300(新配)；β-actin和二抗按说明书稀释至1:5000
               曝光时间从30s延长到10min，条带几乎没什么变化

跪求指教啊！！！

marker.jpg

曝光条带.jpg

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随心而动，如风自在

1楼 2014-05-08 20:50:41

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sunrq516516

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

引用回帖:

16楼: Originally posted by kingsa at 2014-05-11 22:14:42
我这两天把转好的膜用TBST洗涤3便后浸于丽春红中震摇10min，再用TBST洗后发现膜上除了marker还是没有条带。这是不是说明电泳或电转出了问题呢？...

(⊙v⊙)嗯……我们转后不洗直接扔在丽春红里。而且不用那么久，漂两漂就出来了……话说你有染色后的照片可以看下吗？因为没有条带有各种情况……所以如果有图可以看一下就是最好啦。

你是染了整个膜都没有一条带吗？低分子量的有出来么？高分子量看不出带很正常，但如果低分子量没出来就很奇怪了。marker的形状正常吗？听上去比较像转膜的问题。

换其他内参也是可以试试的，不过现在看来真的是转膜或者电泳出问题...你的转膜条件是什么？用的是什么膜？